中國吉林省地區(qū)朝鮮族及漢族正常人群內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因4a／bVNTR多態(tài)性分布的比較研究

李 淼，李 冰，吳 瓊，劉亞芳，丁奎成，全成實(shí)＊

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 病理診斷中心，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 心血管內(nèi)科，吉林 長春130033；3.吉林大學(xué)病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春130021）

內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）為依賴鈣調(diào)蛋白的血管內(nèi)皮固有酶。eNOS經(jīng)多步氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生一氧化氮（nitric oxide，NO），從而刺激血管平滑肌產(chǎn)生cGMP，進(jìn)而維持血管的基礎(chǔ)張力［1，2］。人類eNOS基因位于染色體7q35－36區(qū)，含26個外顯子和25個內(nèi)含子［1］，1994年 Miyahara K 等 人［3］發(fā)現(xiàn)eNOS 基 因內(nèi)含子4上的27bp數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列（vari－able number of tandem repeats，VNTR），根據(jù)重復(fù)次數(shù)不同有兩種等位基因，重復(fù)4次為a等位基因，重復(fù)5次為b等位基因。4a／bVNTR多態(tài)性形成了3種基因型aa、ab和bb。對eN0S基因4a／bVNTR多態(tài)性大量研究發(fā)現(xiàn)，eNOS基因多態(tài)性與心腦血管等疾病關(guān)聯(lián)。目前，有關(guān)eNOS基因多態(tài)性的相關(guān)研究在中國漢族、蒙族和哈薩克族［4］中已有報道，但在中國朝鮮族人群eNOS基因4a／bVNTR多態(tài)性的研究尚未見報道。本研究應(yīng)用PCR等技術(shù)，分析了我國吉林省地區(qū)朝鮮族和漢族正常人群eNOS基因4a／bVNTR多態(tài)性的分布情況，為不同民族eNOS基因4a／bVNTR多態(tài)性分布與慢性病相關(guān)性的前瞻性研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象 經(jīng)過體格檢查及輔助檢查，選取各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍的吉林省地區(qū)正常人群共183人，其中朝鮮族92人（男性42人，女性50人），漢族91人（男性41人，女性50人）。年齡分布在40歲到76歲之間，平均年齡55歲。病史詢問主要排除高血壓病，糖尿病，心腦血管疾病，腫瘤等目前被證實(shí)與遺傳有關(guān)的疾病。受檢者采外周靜脈血2ml，4℃保存至提取基因組DNA。

1.2 方法 采用PCR等技術(shù)對中國吉林省地區(qū)朝鮮族正常人群92人和漢族人群91人的eNOS基因4a／b VNTR多態(tài)性進(jìn)行了檢測，同時對其分布特征進(jìn)行了分析。

1.2.1 基因組DNA提取 保存的含EDTA血樣用淋巴細(xì)胞提取液（鼎國公司）進(jìn)行淋巴細(xì)胞分離，然后常規(guī)進(jìn)行基因組DNA提取。

1.2.2 PCR擴(kuò)增eNOS基因的特異片斷 參照文獻(xiàn)［5］設(shè)計(jì)引物，引物序列如下；forward：5′－AGG CCC TAT GGT AGT GCC TTT－3′，reverse：5′－TCT CTT AGT GCT GTG GTC AC－3′。引物由上海生工合成。用PCR試劑盒（TAKALA公司）進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為20μl，其中含上下游引物各0.4μl，模板 DNA0.3μl，TagDNA 聚合酶混合物10μl，加去離子水9μl。在PCR擴(kuò)增儀（PTC－100，MJ Reseach.公司）上進(jìn)行如下循環(huán)：95℃熱啟動5min，95℃變性1min，57℃退火1 min，72℃延伸1min，共35個循環(huán)后72℃延伸7 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物7μl，在4%的瓊脂糖凝膠中電泳1h，在紫外照射儀上觀察結(jié)果并攝影。

1.2.3 eNOS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) eNOS基因型多態(tài)性表現(xiàn)為數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR），6次重復(fù)等位基因的PCR擴(kuò)增片斷長447bp，包括162bp的重復(fù)序列（6＊27 bp）和285bp上下游側(cè)翼序列；5次和4次重復(fù)等位基因的PCR產(chǎn)物分別為420bp和393bp，其中重復(fù)序列分別為135bp（5個27bp的重復(fù)序列）和108bp（4個27bp的重復(fù)序列）［6］。eNOS基因第4內(nèi)含子上有兩種等位基因，27bpVNTR重復(fù)4次為a等位基因，重復(fù)5次為b等位基因［7］。eNOS基因4a／bVNTR多態(tài)性形成了3種基因型aa，ab和bb。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以基因計(jì)數(shù)法計(jì)算正常人的基因型和等位基因頻率。用χ2檢驗(yàn)及 Hardy－Weinberg平衡評估標(biāo)本的群體代表性。并用χ2檢驗(yàn)評估等位基因及基因型頻率的差異。應(yīng)用SPSS1 2.0軟件包作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 經(jīng)擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)，eNOS4a／bVNTR基因的基因型頻率在朝鮮族和漢族人群中的分布符合Hardy－Weinberg遺傳平衡定律，P＞0.05，表明樣本具有群體代表性。

2.2 吉林省地區(qū)朝鮮族和漢族健康人群eNOS4a／bVNTR基因型檢測 eNOS基因的PCR產(chǎn)物為420bp和393bp，eNOS基因4a／bVNTR多態(tài)性形成了3種基因型aa，ab和bb，見圖1。92例朝鮮族正常人群中，aa型4名，ab型28名，bb型60名，3種基因型的頻率分別為0.043 48、0.304 3和0.652 2；在91例漢族正常人群中，aa型2名，ab型13名，bb型76名，3種基因型的頻率分別為0.021 98、0.142 9和0.835 2。吉林省地區(qū)朝鮮族eNOS基因aa＋ab基因型頻率顯著高于漢族（χ2＝8.026，P＜0.01），見表1。

2.3 吉林省地區(qū)朝鮮族和漢族健康人群eNOS基因等位基因檢測 吉林朝鮮族a和b兩種等位頻率分別為0.195 7和0.795 7；漢族a和b等位基因頻率分別為0.093 4和0.906 6，兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝7.724，P＜0.01），見表1。

圖1 eNOS基因多態(tài)性位點(diǎn)電泳圖

表1 吉林朝族與漢族人群人eNOS基因4a／bVNTR多態(tài)性及等位基因分布

3 討論

eNOS是左旋精氨酸一氧化氮途徑的關(guān)鍵酶，其催化生成的NO具有舒張血管、調(diào)節(jié)血流、阻止腎素－血管緊張素的產(chǎn)生及抑制血小板聚集等作用［8］。目前認(rèn)為，eNOS基因多態(tài)性與心腦血管等疾病關(guān)聯(lián)。有關(guān)朝鮮族和漢族正常人群的基因4a／bVNTR多態(tài)性的研究尚未見報道。人類基因多態(tài)性具有種族差異，這種差異可以造成不同人群對某些疾病的易感性不同。人類疾病幾乎都是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，只是二者所占的比重在不同的疾病中有所不同。

關(guān)于吉林省地區(qū)朝鮮族和漢族健康調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，朝鮮族心腦血管病的死亡率明顯高于當(dāng)?shù)貪h族［9］。這種差異可能與不良生活方式有關(guān)，但與遺傳因素的關(guān)系尚未見研究報道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，92例朝鮮族正常人群中，aa型4名，ab型28名，bb型60名，3種基因型的頻率分別為0.043 48、0.304 3和0.652 2。91例漢族正常人群中，aa型2名，ab型13名，bb型76名，3種基因型的頻率分別為0.021 98，0.142 9 和 0.835 2。eNOS 基 因 4a／bVNTR多態(tài)性在吉林朝鮮族和漢族間存在種族差異，朝鮮族aa＋ab基因型頻率顯著高于漢族，同時發(fā)現(xiàn)a等位基因頻率明顯高于漢族。提示朝鮮族和漢族eNOS基因多態(tài)性分布可能與人群的生活習(xí)慣等密切相關(guān)。黃惠彬等人［10］研究發(fā)現(xiàn)，eNOS基因27bp VNTR多態(tài)性與中國漢族人高血壓的發(fā)生有關(guān)，攜帶重復(fù)a等位基因的人具有罹患高血壓的危險性。他們認(rèn)為eNOS基因27bp VNTR多態(tài)性a等位基因攜帶者血管內(nèi)皮的NO合成減少，損傷阻力血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，引起外周血管阻力增加從而引起舒張壓增高［11］。人們同時發(fā)現(xiàn)，NO的缺乏可以加速動脈粥樣硬化的發(fā)展，eNOS基因的改變可影響NOS蛋白的功能及活性，從而降低NO的合成，加速動脈粥樣硬化的發(fā)展［12］。Tsukada等［13］實(shí)，攜帶aa基因型者較bb基因型著血清NO水平降低23%，認(rèn)為內(nèi)含子4的多態(tài)性影響轉(zhuǎn)錄后mRNA的剪接過程，因而人群中不同的eNOS基因型有可能決定了不同個體間eNOS的表達(dá)與功能上的差異，進(jìn)而影響到體內(nèi)eNOS的生物學(xué)效應(yīng)。鑒于中國人心血管病的發(fā)病率及死亡率均低于歐美國家，除環(huán)境、飲食等因素外，某些遺傳因素或許起著重要的作用。因此，獲得我國吉林省地區(qū)朝鮮族及漢族人群eNOS基因多態(tài)性位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)資料，對于進(jìn)一步研究基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性將具有重要的應(yīng)用價值。

［1］Anouk M，Tricia L，Sharon C，et al.In vivo expression profile of an endothelial nitric oxide synthase promoter－reporter transgene［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2000，278：1352.

［2］Taddei S，Virdis A，Mattei P，et al.Defective L－arginine／nitric oxide pathway in offspring of essential hypertension patients［J］.Circulation，1996，4：1298.

［3］Miyahara K，Kawamoto T，Sase K，et al.Cloning and structural characterization of the human endothelial nitric－oxide－synthase gene［J］.Eur J Biochem，1994，223（3）：719.

［4］徐新娟，汪師貞，林仁勇等.新疆哈薩克族高血壓患者內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因 G894T多態(tài)性研究［J］.高血壓雜志，2004，12（2）：131.

［5］Wang X ，Sim A，Badenhop R，et al.A smoking－dependent risk of coronary artery disease associated with a polymorphism of endothelial nitric oxide synthase gene［J］.Nat Med，1996，2：41.

［6］Uwabo J，Scoma M，Nakayama T，et al.Association of a variable number of tandem repeats in the endothelial constitutive nitric oxide synthase gene with essential hypertension in Japanese［J］.Am J Hypertens，1998，11：125.

［7］李東寶，華 琦，皮 林，等.內(nèi)皮性一氧化氮合酶4b／a基因多態(tài)性與纈沙坦降壓療效的關(guān)系［J］.中華老年心血管病雜志，2005，7（3）：168.

［8］Lefer AM.Nitric oxide：nature’s naturally occurring leukocyte inhibitor［J］.Circulation，1997，95（3）：553.

［9］延吉市朝鮮族和漢族老年人血壓與體內(nèi)脂肪的關(guān)系及差異［J］.中國臨床康復(fù)，2005，9（15）：20.

［10］黃惠彬，林麗香，陳鳴欽.內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓、2型糖尿病的關(guān)系［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2002，18：16.

［11］路 萍，呂 星，邢瑞云等.內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合酶基因多態(tài)性與高血壓病的相關(guān)性研究［J］.中華心血管病雜志，2001，30：71.

［12］Yoon S，Shin C，Park HY，et al.Endothelial nitric oxide synthase gene is Associated with vessel stenosis in Korean population［J］.Clinica Chimica Acta，2005，353：177.

［13］Tsukada T，Yokoyama K，Arai T，et al.Evidence of association of the ecNOS gene polymorphism with plasma NO metabolite levels in humans［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998，245（1）：190.