豬小腸與犬食管脫細胞基質(zhì)（ECM）構建組織工程化人工食管的比較研究

李春霖，薛錦儒，崔建華

（吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 胸外科，吉林 長春130033）

食道癌是我國北方人群中的一種高發(fā)疾病，外科手術是治療該病的首選方法。然而，手術所造成消化道結構的改變以及對消化生理的影響是不可逆轉的，所以長久以來人們一直在尋找一種食管替代物以代替病變食管，人工食管的研究逐漸成為胸外科對食道病損治療探索的主要課題。盡管用不同的材料和組織進行過許多人工食管的研究［1］，直到組織工程技術的興起才為人工食管的發(fā)展開辟了廣闊的前景。采用組織工程技術體外構建人工食管，是人工食管研究的一種新的方法，其中種子細胞的選擇、支架材料的研制、種子細胞與支架材料的復合是整個研究的關鍵所在。

我們采用了犬骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）做為種子細胞，豬小腸脫細胞基質(zhì)膜（IECM）作為載體支架，分別以犬自體食道脫細胞基質(zhì)（EECM）和人工滌綸材料補片（ePTFE）作為對照，比較研究BMSCs在上述三種材料上的生長情況。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 本地白豬，體重35kg左右 ，雌雄不限；本地家犬，雄性，10月齡左右，體重約15 kg。實驗過程中對動物處置均符合動物倫理學的要求。

1.1.2 主要試劑 狗骨髓間質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基（美國cyagen公司），重組人堿性成纖維細胞生長因子（美國peprotech公司），胰蛋白酶（美國Sigma公司），CD29，CD34，CD44，CD45，CD90，CD105流式抗體（美國Beckman公司）等。

1.1.3 主要設備 掃描電子顯微鏡（日本Olympus公司），倒置相差顯微鏡（日本電子公司），流式細胞儀（美國Beckman公司）等。

1.2 方法與步驟

1.2.1 細胞外基質(zhì)膜的制備及處理 取新鮮豬小腸若干，選自空腸部分。沿縱軸切開，特制裝置下固定，以眼科剪在肌層剪出一系列稠密切口，切口深度不可超出肌層。用自制刮除器將肌層仔細刮除，然后將其翻轉，以同樣的方法將小腸的粘膜層刮除干凈，所剩下白色菲薄，半透明的膜狀物即為脫細胞基質(zhì)膜（ECM），如圖－1所示。在刮除過程中，應間斷生理鹽水沖洗，以保持其表面的濕潤性。制備好的ECM標本再經(jīng)進一步化學方法處理［2］，材料與溶液體積的比例均保持在1∶100。首先在100mmol／L的乙二胺四乙酸（EDTA）和10mmol／L氫氧化鈉的溶液（ph值為11－12）中浸泡16h，用去離子水沖洗干凈后浸泡于含1mmol／L鹽酸和1mmol／L氯化鈉的溶液（ph值為0－1）中6－8h，去離子水沖洗，置于含1mmol／L氯化鈉的PBS溶液中16h，去離子水沖洗，PBS浸泡2h后再次用大量去離子水仔細沖洗，－80℃凍存，真空干燥機冷凍干燥后粒子加速器25kGy照射滅菌［3］。ECM標本做電鏡掃描觀察。

圖1 脫細胞處理的豬小腸基質(zhì)膜IECM

1.2.2 MSCs的體外分離、培養(yǎng)及擴增 取10月齡本地家犬一只，體重約為16.5kg，備皮，常規(guī)麻醉后固定于實驗臺，選好穿刺點，取一次性骨穿包，消毒鋪巾。穿刺成功后取50ml注射器并預抽2ml肝素鈉以抗凝，抽取骨髓血20ml左右后將穿刺點加壓包扎。迅速于無菌操作臺中，將骨髓血轉入50 ml離心管，并加入20ml PBS，1 500rad／min，離心8min。棄上清，再次加入30ml PBS，再次離心棄上清后加入6ml培養(yǎng)基，吹打混勻，等量接種于兩個培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱中，隔天換液，待換液兩次后即可于顯微鏡下觀察到幾簇梭形、貼壁生長的細胞群，為原代細胞，記為P0。當鏡下觀察幾簇細胞密度過大時，吸出培養(yǎng)基，加入適量的0.25%胰酶后放于培養(yǎng)箱中消化細胞重新鋪皿，消化完成后重新加入培養(yǎng)基，適量的FGF－basic，搖晃均勻后標記為P1，置于培養(yǎng)箱。隔天換液，待鏡下觀察細胞生長至90%融合時，再次消化，并以1∶3傳代。重復如上操作，反復傳代擴增以備使用。

1.2.3 MSCs生長曲線的繪制 分別取生長狀態(tài)良好的1、3、5代的細胞，0.25%胰酶消化后，以1×104／孔的密度接種于6孔板中，單獨培養(yǎng)，用于細胞計數(shù)。根據(jù)計數(shù)結果以細胞數(shù)量為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標繪制生長曲線。

1.2.4 MSCs流式細胞儀檢測 取消化后的P2細胞，加入PBS，制成細胞懸液，PBS洗滌2次后，細胞懸液調(diào)整為密度106／ml，分裝至7只試管中，6個分別 加 入 5 μl CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105抗體，避光染色30min，1個作為空白對照，PBS洗滌兩次后重懸細胞，上機，開始流式細胞儀測試。

1.2.5 MSCs與支架材料的復合 分別取大小為2 cm×2cm的IECM，EECM，ePTFE，分別以EECM和ePTFE作為對照組，IECM作為實驗組。粒子加速器滅菌處理后分為3組，每組20個，PBS浸泡24 h后置于6孔板中，將第二代MSCs以密度1×107／ml分別接種于其表面，3h后加入適量培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中，每48h更換培養(yǎng)液。15d后取出標本做石蠟切片，HE染色觀察。

1.2.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ECM掃描電鏡觀察結果 ECM經(jīng)過脫細胞處理過的基質(zhì)膜表現(xiàn)出良好的立體三維空間結構，具有均勻的空隙率和孔徑，三維孔隙間呈梭狀結構，并且之間相互連通。細胞層已經(jīng)完全去除，沒有細胞以及細胞碎片成分的殘留；表面彈性蛋白網(wǎng)狀結構完整、排列整齊，顯示出規(guī)則的孔隙結構，而且單根的纖維結構沒有明顯的膨脹或碎裂。如圖2所示，可見清晰的纖維網(wǎng)狀結構。

圖2 脫細胞基質(zhì)膜電鏡掃描

2.2 MSCs的形態(tài)學觀察及增值情況 原代細胞消化重鋪貼壁后可見皿底細胞均勻分布呈長梭形纖維細胞狀，漂浮著少量為貼壁的細胞，換液即可除去。加入FGF－basic后貼壁細胞迅速增值分裂，6－7 d細胞已鋪滿瓶底，融合至95%，呈旋渦狀排列整齊有序，雜質(zhì)細胞已經(jīng)明顯少見，如圖3。

圖3 犬骨髓間充質(zhì)干細胞P2培養(yǎng)存化過程2d，4d，6d，8d，（×100）

2.3 MSCs的生長曲線 第1、3、5代細胞培養(yǎng)1－2 d，細胞增值較慢，為潛伏期，此后，細胞生長分裂速度明顯加快，呈指數(shù)形式增長，進入第8天生長速度減慢，進入平臺期，如圖4，此時細胞幾乎鋪滿皿底。

圖4 犬骨髓間充質(zhì)干細胞第1、3、5代生長曲線

2.4 MSCs表面抗原檢測 對P2細胞進行流式細胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)細胞強表達間充質(zhì)干細胞抗原CD29、CD44、CD90、CD105［4］，表達率分別為 95.7%、98.4%、99.0%和100%，幾乎不表達 CD34、CD45，如圖5所示，說明實驗中所分離提取培養(yǎng)的細胞是BMSCs。

2.5 細胞與材料復合結果 BMSCs與各組支架復合培養(yǎng)15d后觀察。觀察培養(yǎng)基成分，判斷有無污染，各組結果分別為：EECM組標本污染3個，IECM組與ePTFE組標本各污染1個，污染原因考慮可能為操作中的失誤。取無污染的標本做HE染色，可見BMSCs與IECM組、EECM 組、ePTFE組復合結果分別為17、15、8，復合率為85%、75%、40%，觀察結果如圖6所示。以IECM組作為實驗組，EECM組作為對照組時，復合結果無顯著性差異（P＞0.05）；ePTFE組作為對照組時，復合結果有顯著性差異（P＜0.05），說明IECM 和EECM 與BMSCs復合效果相似，而ePTFE與BMSCs復合效果不如IECM。

圖5 P2代犬骨髓間充質(zhì)干細胞流式表面抗體鑒定

圖6 A：復合培養(yǎng)后ECM上無BMSCs生長B：BMSCs與ECM接種后生長良好 （20×10）

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細胞是骨髓基質(zhì)內(nèi)的非造血細胞來源的細胞亞群，為成體干細胞，可在體外經(jīng)誘導分化為多種細胞類型［5－7］。具有取材方便，易分離培養(yǎng)，增殖能力強，機體幾乎沒有移植排斥反應的發(fā)生，即使發(fā)生，程度也比較輕微，易于處理［8］，是目前公認的組織工程最佳種子細胞。

具有細胞相容性是對組織工程支架材料最基本的要求。本文在總結以往研究的基礎上，經(jīng)過物理化學相結合的方法，制備出脫細胞基質(zhì)膜。ECM有良好的組織相容性［9］，可為種子細胞提供遷移、附著、增殖的環(huán)境，還可與宿主結合，促進血管的再生［10］，植入體內(nèi)后還可使周圍組織相鄰組織細胞沿支架移行和生長［11］，由于去除了細胞成分，此種來自異種動物的生物材料沒有抗原性，在宿主體內(nèi)不發(fā)生免疫排斥反應［12］，所以用ECM制備人工食管技術上是可行的［13］。

本實驗研究為構建人工食管，將BMSCs與IECM接種后分別于EECM和ePTFE做對比研究，發(fā)現(xiàn)BMSCs均可與徹底滅菌的3種材料實現(xiàn)復合，但在接種成功率方面天然生物材料ECM要明顯高于人工材料ePTFE，與此同時雖然部分ePTFE也能夠與種子細胞復合培養(yǎng)成功，但完全不具備收縮功能，體內(nèi)組織再生后其不能被降解吸收，將作為異物長時間存在。接種BMSCs培養(yǎng)后的IECM與EECM生物學性狀相似，能夠實現(xiàn)功能和生理的再生［14］，因此優(yōu)于人工材料ePTFE，而且IECM來源廣泛，成本低廉，人工操作性極大，所以以BMSCs為種子細胞與IECM支架復合構建組織工程化的人工食管，從理論上可以真正實現(xiàn)生理意義上的食管再生。

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