實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期鐵調(diào)素表達的變化☆

劉瀏 譚關(guān)平 陳耀隆 詹傲 熊偉茗 何朝暉

早期腦損傷（early brain injury,EBI）是蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）患者死亡和殘疾的首要原因，細胞凋亡是其最主要的病理機制[1,2]。腦鐵含量增加催化的活性氧簇（reac?tive oxygen species，ROS）反應(yīng)性增強是導(dǎo)致細胞凋亡的重要原因之一[3,4]。新近的研究[5]提示，細胞內(nèi)鐵代謝紊亂是腦鐵含量增加的新機制。鐵調(diào)素（hepcidin）被認(rèn)為是調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的最重要的類激素物質(zhì)，可通過干擾鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白影響鐵代謝平衡[6]。Hepcidin表達水平的增高會導(dǎo)致體內(nèi)鐵含量的蓄積，但SAH后腦鐵含量增高是否與鐵調(diào)素的變化有關(guān)尚需進一步探明。本實驗通過復(fù)制大鼠SAH模型，觀察SAH后大鼠海馬Hepcidin的表達與總鐵含量的關(guān)系，探討Hepcidin在SAH后腦鐵代謝紊亂中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 健康成年雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量250～300g,由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。隨機將大鼠分為假手術(shù)（對照）組和蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）組，其中SAH組根據(jù)處理時間分為12、24、48、72h 4個組，總共5組，每組各18只大鼠（其中6只用于免疫組化檢測，6只用于檢測West?ern-blot，6只用于檢測海馬鐵含量）。

1.2 SAH模型制作 以水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，常規(guī)消毒，分離右側(cè)股動脈，留置結(jié)扎線。將動物固定于腦立體定位儀上，沿顱頂正中矢狀線切開頂部中線皮膚，鈍性分離骨膜，在距前囟前5mm，中線旁3mm處用電動牙科鉆鉆孔，孔徑為1.0mm，小心挑破硬膜，將PE10細導(dǎo)管緊貼前顱窩底蛛網(wǎng)膜下腔送至顱底動脈環(huán)，置管深度約1cm。連接注射器回抽見有清亮腦脊液流出，證實導(dǎo)管進入蛛網(wǎng)膜下腔后，以皮試針經(jīng)股動脈穿刺抽取自體動脈血0.3mL，立即在30s內(nèi)緩慢注入蛛網(wǎng)膜下腔。拔出導(dǎo)管，封閉骨孔，縫合皮膚，保持頭低位30min。假手術(shù)對照組動物按上述方法操作，但蛛網(wǎng)膜下腔置管后不注血。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測Hepcidin蛋白的表達 腦組織用4%多聚甲醛灌注固定，石蠟包埋切片，厚約4μm。按照說明書采用SP法進行染色。以PBS代替一抗作陰性對照。Hepcidin一抗?jié)舛?:200(美國Abcam公司)。采用Image-Pro Plus5.0圖像分析系統(tǒng)對免疫組化結(jié)果進行掃描，半定量分析Hepcidin在對照組和SAH組中的表達。每張切片觀察5個視野，所有切片在同一放大倍數(shù)（400×）、同一光強度下照相，以平均光密度值定量比較，細胞膜上出現(xiàn)棕黃色為陽性反應(yīng)。

1.4 Western blot法檢測Hepcidin蛋白 取海馬組織于勻漿器中，加入組織裂解液，振蕩或渦旋混勻，冰水浴裂解20～30 min。加入上樣緩沖液強力混勻，置100℃的水浴箱中水浴加熱3～5min，4℃下12000r/min離心15min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度并標(biāo)化。蛋白樣品加入變性緩沖液于沸水中煮5min，10000r/min離心5min后上樣。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜。于5%脫脂牛奶中4℃封閉過夜；分別加入抗 Hepcidin 抗體(美國 Abcam，1：100)、抗β-actin抗體（北京中杉公司1∶3000）置于4℃孵育過夜；加入二抗goat anti rabbit（北京中杉公司，1:2000）于37℃孵育1 h。按1：1配制A、B發(fā)光液，凝膠成像儀與Quantity One軟件照相顯影，分析結(jié)果。采用β-actin為內(nèi)參照。

1.5 原子吸收光譜法測定大鼠海馬中鐵含量 大鼠經(jīng)冷生理鹽水灌注后，取新鮮腦組織，分離海馬，用離子水沖洗兩遍，濾紙吸干表面，置入EP管中于-80℃保存。電子分析天平稱每個標(biāo)本的質(zhì)量，標(biāo)本加入硝酸高氯酸（V硝酸：V高氯酸=4:1）20mL，避光消化10h，中溫加熱，消解至無色透明，高溫加熱揮發(fā)完余酸，冷卻后加入去離子水10mL，加熱至近干，用2%HNO3移入比色管，定容至10mL，用原子吸收光譜儀測定鐵濃度。腦鐵含量的計算：提取物鐵濃度（ppm）×10mL/標(biāo)本質(zhì)量（mg）。

2 結(jié)果

2.1 大鼠海馬組織免疫組化檢測結(jié)果 Hepcidin在假手術(shù)對照組的海馬神經(jīng)元中僅有弱陽性表達（圖1A）,而在SAH組中檢測到很強的Hepcidin陽性表達細胞（圖1B）。在SAH組各時間點hepcidin表達逐漸增高，大鼠SAH后72h增高最明顯，SAH后各時間點Hepcidin在海馬神經(jīng)元的表達量與假手術(shù)對照組比較均明顯增加(F=31.911，P＜0.05)。見圖1，表1。

2.2 大鼠海馬組織內(nèi)Hepcidin蛋白的表達 West?ern blot檢測到假手術(shù)對照組有Hepcidin蛋白的表達，實驗組SAH后12h Hepcidin蛋白表達開始增高，SAH后72h時Hepcidin表達最高，各時相點與假手術(shù)對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(F=147.314,P＜0.05)。見圖2。

2.3 大鼠海馬鐵含量的變化 原子吸收分光光譜法顯示，大鼠SAH后海馬鐵含量明顯增高，與假手術(shù)對照組比較，大鼠SAH后海馬鐵含量在12h、24h、48h、72h呈逐漸增高趨勢，其SAH后72h時鐵含量最高（F=28.799,P＜0.05）（表1）。

2.4 大鼠海馬Hepcidin蛋白的表達與海馬鐵含量的相關(guān)性 大鼠海馬組織Hepcicin蛋白的表達量與海馬鐵含量成正相關(guān)（r=0.914，P＜0.05）。

3 討論

圖1 免疫組化檢測SAH后72h Hepcidin的表達情況。A：對照組大鼠海馬（400×）；B：SAH組大鼠SAH 72h后海馬（400×），黑色箭頭示Hepcidin陽性表達細胞

圖2 Western blot檢測大鼠海馬Hepcidin的表達情況。1：假手術(shù)對照組；2：SAH后12h；3：SAH后24h；4：SAH后48h；5：SAH后72 h

表1 大鼠海馬組織Hepcidin的蛋白表達和鐵含量

SAH后早期腦損傷（EBI）可能是SAH患者致死致殘率較高的首要原因[7]，腦血管痙攣可造成嚴(yán)重腦缺血及腦損傷。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，SAH后早期血管痙攣是血塊分解代謝釋放的血管活性物質(zhì)所致，而腦內(nèi)鐵含量的增高是血塊中血紅蛋白分解的結(jié)果[8]。近期研究表明，腦細胞內(nèi)鐵代謝紊亂可導(dǎo)致腦內(nèi)鐵含量增高，提示SAH后腦鐵含量增高可能與腦細胞內(nèi)鐵代謝紊亂有關(guān)[9]。SAH后早期，海馬中可觀察到細胞凋亡的發(fā)生，鐵離子作為生物分子氧化的主要催化劑可產(chǎn)生反應(yīng)性極強的氧自由基，誘導(dǎo)細胞凋亡[10]。因此，我們推斷，鐵離子在SAH后EBI的發(fā)生過程中起著重要的作用。

腦鐵代謝的平衡至關(guān)重要。腦總鐵含量水平的升高被認(rèn)為在包括阿爾茲海默病和帕金森疾病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用，鐵誘導(dǎo)的氧化損傷與其發(fā)病有關(guān)。腦出血后，腦鐵含量的增高導(dǎo)致大量自由基生成，在腦出血后的腦水腫的發(fā)展過程中起著重要的作用[11,12]。我們推測，腦總鐵含量的升高同樣在SAH后EBI發(fā)展過程中起著重要的作用。本實驗采用視交叉前池單次注血法構(gòu)建大鼠SAH模型，原子吸收分光光譜法檢測海馬總鐵含量發(fā)現(xiàn)，SAH后各時間點大鼠海馬總鐵含量逐漸增加，在72h最多，證實SAH后早期大鼠海馬總鐵含量增高。我們推斷，在SAH后腦組織總鐵含量水平的升高，鐵離子可產(chǎn)生反應(yīng)性極強的羥自由基，從而激發(fā)過氧化反應(yīng)引起細胞凋亡，可能參與了SAH后EBI的發(fā)生發(fā)展過程。

Hepcidin也稱肝臟抗菌多肽，是在肝臟合成并富含半胱氨酸的抗菌多肽[13]。近年來被認(rèn)為是調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的最重要類激素類物質(zhì)，廣泛分布于鼠類的皮層、海馬和基底節(jié)區(qū)等部位，與多種鐵代謝蛋白有著密切的關(guān)系。膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1（ferro?portin1,Fpn1）、銅藍蛋白（ceruloplasmin，CP）和二價金屬轉(zhuǎn)運體（divalent metal transporter 1，DMT1）等鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白可影響鐵含量紊亂，在鐵代謝過程中發(fā)揮重要作用[14]。Li L等通過側(cè)腦室內(nèi)注射Hepcidin對大鼠海馬區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，Hepcidin可以抑制Fpn1及Fpn1 mRNA的表達，還可下調(diào)CP及其mRNA的表達，另可顯著促進組織中DMT1的表達，且具有明顯的區(qū)域特異性[15]。我們推測在SAH后EBI發(fā)展過程中，Hepcidin表達可能增加，通過對上述重要的鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白調(diào)控，進而影響腦組織中的總鐵含量。

通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，大鼠在建模后12h海馬Hepcidin蛋白的表達明顯增加，至72h時表達最高。免疫組化同樣證實了海馬Hepcidin在SAH后早期的上調(diào)，其表達改變與海馬總鐵含量的變化時程相吻合。同時經(jīng)相關(guān)性分析，SAH后Hepcidin的蛋白表達與海馬組織的總鐵含量呈明顯正相關(guān)。

因此，我們推測，SAH后Hepcidin的表達增高可能與海馬總鐵含量的水平升高有關(guān)，本實驗結(jié)果提示SAH后引起Hepcidin的表達增高，可能通過對鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的影響調(diào)控，導(dǎo)致細胞內(nèi)鐵代謝紊亂，最終引起海馬的總鐵含量增高，為今后進一步研究SAH后腦鐵代謝紊亂奠定了實驗基礎(chǔ)。本研究目前只能通過Hepcidin蛋白表達和總鐵含量的相關(guān)性，推測兩者之間的可能機制，這是本文的不足之處，在后期的實驗中，我們將進行鐵轉(zhuǎn)運蛋白與海馬神經(jīng)元細胞凋亡的檢測，來進一步探討Hepcidin參與SAH后腦鐵代謝紊亂及EBI整個病理過程的相關(guān)機制，將可能為SAH的治療提供新的思路。

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