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    丹酚酸B通過Akt-eNOS通路對大鼠心肌缺血/再灌注損傷保護(hù)作用的研究*

    2013-11-22 01:09:06朱艷榮王艷華奚苗苗文愛東
    陜西中醫(yī) 2013年1期
    關(guān)鍵詞:丹參心肌梗死心肌

    周 丹 權(quán) 偉 關(guān) 月 朱艷榮 郭 超 王艷華 奚苗苗 文愛東

    第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科 (西安710032)

    缺血性心臟病是當(dāng)今世界威脅人類健康的首敵。隨著冠狀動(dòng)脈內(nèi)溶栓和冠脈搭橋等內(nèi)外科治療手段的廣泛應(yīng)用,繼之出現(xiàn)的心肌缺血/再灌注 (myocardia1ischemia/reperfusion,MI/R)損傷日益受到心臟病學(xué)家的高度重視。中藥治療MI/R損傷療效確切、前景良好。許多從中藥中分離得到的化合物都具有抗MI/R損傷的作用,其中對于丹參心肌保護(hù)作用的研究最為引人關(guān)注。

    丹參(Radix Salviae Miltiorrhizae)為唇型科植物丹參的干燥根及根莖。丹參的有效成分復(fù)雜,主要有丹參酚、丹參素、丹參酮等?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),丹參的不同提取物具有抗氧化、抗炎、擴(kuò)血管、抑制凋亡等作用[1-4]。丹酚酸 B(Salvianolic acid B,Sal B)是丹參的水溶性成分,有研究表明Sal B對大鼠MI/R損傷具有保護(hù)作用[5,6],但其分子作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制大鼠 MI/R損傷模型,觀察Sal B對大鼠 MI/R損傷的保護(hù)作用,并進(jìn)一步研究Akt-eNOS通路在Sal B心肌保護(hù)中的可能作用,為Sal B用于MI/R損傷的防治提供新的理論依據(jù)。

    1 材 料 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級雄性健康SD大鼠40只,體質(zhì)量250~270g,購自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)(環(huán)境溫度24℃,濕度60%~70%),術(shù)前12h禁食,自由飲水。將大鼠隨機(jī)分為4個(gè)組,即假手術(shù)組、模型組、Sal B低及高劑量組,每組10只。

    1.2 主要藥品與試劑 Sal B(貴州迪達(dá)科技有限公司);肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)(上海西唐生物科技有限公司);乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所);2,3,5-氯化三苯基四氮唑藍(lán)(Tetrazolium chloride,TTC)染色劑(中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司);伊文思藍(lán)(Evans Blue,EB)(美國Sigma-Aldrich公司)。RIPA buffer蛋白裂解液和苯甲基磺酰氟化物(碧云天生物技術(shù)研究所);兔抗鼠Akt和p-Akt(Ser473)單克隆抗體、兔抗鼠eNOS和p-eNOS(Cell Signaling Technology公司);辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG(北京中山生物技術(shù)公司);ECL底物發(fā)光顯色試劑盒(HRP發(fā)光)(北京雷根生物技術(shù)有限公司)。

    1.3 主要儀器 HX-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司);TDZ4A-WS低速臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司);COOLPIX S1型照相機(jī)(Nikon公司,日本);680型酶標(biāo)儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像儀(BIO-RAD公司);5417型低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司)。

    2 方 法 2.1 給藥方法 假手術(shù)組和模型組大鼠均于再灌注開始時(shí)經(jīng)頸靜脈給予生理鹽水(2mL/kg);Sal B低、高劑量組大鼠均于再灌注開始時(shí)經(jīng)頸靜脈給予Sal B溶液(20,60mg/kg)。

    2.2 造模方法 大鼠稱重后,2mL/kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉,仰臥位固定,連接心電圖監(jiān)測,氣管插管并接呼吸機(jī)(頻率:75次/min;潮氣量:8~9mL;吸:呼=1:2),胸骨左緣旁縱行切開第3~5肋間做橫行切口,剪開并挑起心包,暴露心臟,以左心耳與肺動(dòng)脈圓錐交界處的左冠狀動(dòng)脈前降支(Left anterior descending coronary aery,LAD)為標(biāo)志,于左心耳下方1~2mm處進(jìn)針、穿線(橫跨左冠狀動(dòng)脈前降支),將一小硅膠管從絲線兩端穿入,穩(wěn)定10min后結(jié)扎,缺血30min后,再灌注3h結(jié)束。成功標(biāo)準(zhǔn)[7]:結(jié)扎LAD后心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST段出現(xiàn)弓背向上抬高,T波高聳等為缺血成功;放松結(jié)扎線后,抬高的ST段下降1/2以上為再灌注成功。假手術(shù)組動(dòng)物只穿線,不結(jié)扎,其余兩組均進(jìn)行30min缺血和3h再灌注。

    2.3 心肌梗死面積測定[8]再灌注3h后,再次結(jié)扎各組大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支,從頸動(dòng)脈迅速注入3%EB溶液2 mL,待大鼠口唇及四肢末梢皮膚藍(lán)染后迅速摘除心臟,濾紙吸除心室腔中殘余染液,-80℃凍存。取出后自心尖向心底平行房室溝方向?qū)⑵淝谐上嗟群穸鹊?片,2%TTC溶液(pH=7.4)37℃孵育10min,4%多聚甲醛固定過夜。染色后白色代表梗死區(qū)(area of necrosis,AN),紅色代表缺血但未梗死區(qū),藍(lán)色代表正常區(qū),危險(xiǎn)區(qū)(area at risk,AAR)為紅色和白色面積之和[9,10]。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。梗死程度采用梗死區(qū)面積(AN)與危險(xiǎn)區(qū)面積(AAR)的比值表示。

    2.4 血清生化指標(biāo)測定 再灌注3h后,腹主動(dòng)脈取血,分離血清,離心(4000r/min)12min,試劑盒檢測 CK-MB和LDH的活性。

    2.5 Akt、p-Akt及eNOS、p-eNOS蛋白表達(dá)測定 每組取4只大鼠,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后迅速剪取左心室前壁心肌組織,立即放入-80℃冰箱中保存。標(biāo)本取齊后在冰上剪碎、加入適量的裂解液提取心肌總蛋白,4℃下20000g離心20min,取上清,放入-20℃冰箱中備用。Western blot檢測 Akt、p-Akt及eNOS、p-eNOS蛋白表達(dá)。取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫封閉1h后,加入相應(yīng)兔抗鼠一抗(Akt 1:1000,p-Akt 1:1000或 p-eNOS 1:1000,eNOS 1:1000),4℃ 孵育過夜。加入羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(1:2000稀釋),室溫孵育1h。加入ECL顯色液,曝光顯影,凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。

    3 結(jié) 果 3.1 Sal B對缺血/再灌注大鼠心肌梗死面積的影響 大鼠缺血30min再灌注3h后,模型組動(dòng)物心肌出現(xiàn)明顯的梗死,梗死區(qū)面積與危險(xiǎn)區(qū)面積的比為(58.09±2.76)%。與假手術(shù)組相比,模型組動(dòng)物心肌梗死面積顯著增加(P<0.05),提示 MI/R損傷模型制作成功。而Sal B低、高劑量組梗死區(qū)面積與危險(xiǎn)區(qū)面積的比分別為(40.41±4.26)%,(29.99±5.41)%。與模型組相比,Sal B低、高劑量組(20,60 mg/kg)均能明顯降低 MI/R損傷大鼠心肌梗死面積(P<0.05,P<0.05),見圖1。

    圖1 Sal B對MI/R損傷大鼠心肌梗死面積的影響?!鱌<0.05vs假手術(shù)組;▲P<0.05vs模型組

    3.2 Sal B對缺血/再灌注大鼠血清CK-MB和LDH的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清CK-MB和LDH水平明顯增加(P<0.05)。Sal B高劑量組大鼠血清CK-MB和LDH水平明顯下降,與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。Sal B低劑量組大鼠血清LDH水平明顯下降,與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而Sal B低劑量組大鼠血清CK-MB水平有下降趨勢,但與模型組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),見表1。

    表1 Sal B對大鼠心肌梗死面積、血清CK-MB和LDH的影響(±s,n=10)

    表1 Sal B對大鼠心肌梗死面積、血清CK-MB和LDH的影響(±s,n=10)

    注:△P<0.05vs假手術(shù)組;▲P<0.05vs模型組

    組別 劑量(mg/kg) CK-MB(ng/mL) LDH(U/L)假手術(shù)組 /24.26±6.30 29457.50±663.06模型組 / 88.51±32.20△ 62961.12±3506.10△Sal B低劑量組 20 63.83±29.85◇ 41429.33±5759.77▲Sal B高劑量組 60 27.71±8.52▲ 29822.17±1709.51▲

    3.3 Sal B對缺血/再灌注大鼠心肌 Akt、p-Akt及eNOS、p-eNOS蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測顯示,各組Akt、eNOS蛋白表達(dá)均無明顯差異(P>0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組p-Akt/Akt及p-eNOS/eNOS相對灰度值增加(P<0.01),提示 MI/R損傷可引起p-Akt及p-eNOS蛋白表達(dá)升高。與模型組比較,Sal B低、高劑量組 p-Akt/Akt及 p-eNOS/eNOS相對灰度值均顯著增加(P<0.01),表明Sal B低、高劑量組(20,60mg/kg)均可增加Akt及eNOS的磷酸化水平而使其活化,見圖2。

    圖2 Sal B對MI/R損傷大鼠心肌Akt、p-Akt及eNOS、p-eNOS蛋白表達(dá)的影響。△P<0.01vs假手術(shù)組;▲P<0.01vs模型組

    4 討 論 隨著溶栓、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)成形術(shù)等血管再灌注療法的應(yīng)用,可通過恢復(fù)缺血組織的供血有效挽救瀕死心肌[11]。但是再灌注受缺血組織血管再通時(shí)間限制并存在再灌注損傷等問題。大量報(bào)道表明,心肌缺血期間的一些變化已為再灌注損傷的發(fā)生奠定了基礎(chǔ),再灌注損傷是缺血損傷的延續(xù)、擴(kuò)大和惡化[12]。因此,尋找能夠有效防治MI/R損傷的藥物成為醫(yī)藥學(xué)家的研究熱點(diǎn)。越來越多的證據(jù)表明,Sal B對MI/R損傷具有保護(hù)作用,但其具體分子機(jī)制不清。本研究在觀察Sal B對MI/R損傷保護(hù)作用的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討了Akt-eNOS信號通路在其中的關(guān)鍵作用。

    梗死面積被認(rèn)為是衡量MI/R損傷的金標(biāo)準(zhǔn)[13]。由于心肌梗死是不可逆損傷,通常采用AN/AAR百分比來說明缺血/再灌注的損傷程度。在各組大鼠缺血程度基本一致的情況下,AN/AAR百分比越大,說明心肌梗死面積越大,心肌損傷程度越嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Sal B能顯著減少心肌梗死面積,并且隨濃度升高梗死面積明顯下降,提示Sal B對MI/R損傷大鼠的心肌具有保護(hù)作用。長期心肌缺血會(huì)導(dǎo)致心肌梗死、心肌細(xì)胞死亡,心肌缺血時(shí),心肌酶CK-MB和LDH被認(rèn)為是心肌細(xì)胞受損程度的重要標(biāo)志酶[14]。心肌細(xì)胞受損后,血清中CKMB和LDH的水平明顯升高。本實(shí)驗(yàn)證明,Sal B 60mg/kg可顯著抑制MI/R大鼠血清LDH和CK-MB水平的增加,Sal B 20mg/kg可顯著抑制 MI/R大鼠血清LDH水平的增加,進(jìn)一步提示Sal B對MI/R損傷大鼠的心肌具有保護(hù)作用。

    Akt-eNOS是再灌注損傷補(bǔ)救酶(RISK)信號轉(zhuǎn)到通路的組成之一[15],通過影響下游相關(guān)蛋白的表達(dá),對心臟產(chǎn)生保護(hù)作用。該通路有多種效應(yīng)分子,而Akt處在這一通路的中心環(huán)節(jié),也是最主要的靶酶,只有磷酸化的Akt才能具有抗凋亡、蛋白合成及促細(xì)胞生存等活性[16]。研究表明缺血再灌注時(shí)eNOS可發(fā)揮保護(hù)作用,eNOS的高表達(dá)參與血流的調(diào)節(jié),抑制血管痙攣、減少炎性細(xì)胞的浸潤及防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載等再灌注損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[17]。高峰[18]等人發(fā)現(xiàn)胰島素可激活 PI3K-Akt-eNOS信號通路,活化的Akt可使eNOS磷酸化激活,進(jìn)而增加NO的生成、抑制TNF-α的生成,從而減輕 MI/R損傷引起的炎癥反應(yīng),達(dá)到保護(hù)心臟的作用。本研究發(fā)現(xiàn)Sal B 20 mg/kg和60mg/kg均可增加Akt及eNOS的磷酸化水平而使其活化,由此可推斷出Sal B激活A(yù)kt-eNOS信號通路,使效應(yīng)蛋白Akt磷酸化增多,進(jìn)一步激活了下游靶目標(biāo)eNOS使其磷酸化,從而發(fā)揮其對心臟的保護(hù)作用。

    綜上所述,本研究結(jié)果提示Sal B可通過激活A(yù)kt、eNOS的磷酸化而減輕大鼠 MI/R損傷,但是Akt-eNOS信號通路是通過何種機(jī)制被激活以及該通路活化后如何發(fā)揮心肌保護(hù)作用,還有待進(jìn)一步研究。

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