Ang-2、VEGF在進(jìn)展期胃癌中的表達(dá)及與淋巴管生成的相關(guān)性分析

施 怡 李勇 陳石偉

到目前為止手術(shù)仍是唯一的胃癌治愈手段，但即使獲得根治性切除的患者也會有50%～90%的患者術(shù)后復(fù)發(fā)或者死亡，患者5年生存率僅30%［1-2］，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響進(jìn)展期胃癌患者預(yù)后的重要因素。本組研究就促血管生成素(angiopoietin，Ang-2)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在進(jìn)展期胃癌中的表達(dá)及其與淋巴管生成的相關(guān)性進(jìn)行探討，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2008年1月至2011年1月收入的進(jìn)展期胃癌患者共66例，其中男性51例，女性15例，年齡57～73歲，平均年齡(62.1±7.8)歲;低分化腺癌 31例、中分化腺癌19例、高分化腺癌16例。另外選取同批中18例患者的癌旁2～3 cm處胃黏膜組織以及正常的胃組織作為對照，所有患者標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)的診斷所證實?；颊咝g(shù)前均未經(jīng)任何的抗腫瘤治療，經(jīng)10%的甲醛固定，并行常規(guī)石蠟包埋制作成4 mm厚的切片。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組化SP法進(jìn)行染色，Ang-2、VEGF免疫組化試劑盒均購自武漢博士德公司，標(biāo)本經(jīng)常規(guī)二甲苯后給予梯度酒精脫水、水化并高壓修復(fù)，滴加3%的過氧化氫溶液以及山羊血清封閉，滴加一抗過夜，PBS沖洗后滴加生物素標(biāo)記二抗，甩掉PBS液并滴加鏈霉菌抗生物素一過氧化物酶溶液，加入新鮮配置的DAB溶液并于顯微鏡下觀察3～5 min，蘇木精染色30 s，溫?zé)酨BS沖洗，給予梯度酒精脫水，二甲苯透明，給予中性樹膠封片。所有標(biāo)記過的染色標(biāo)本均設(shè)置陽性及陰性對照。

1.3 免疫組化結(jié)果檢測

免疫組化結(jié)果采用雙盲法檢測。Ang-2、VEGF陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):以細(xì)胞膜或者細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色的顆粒作為陽性表達(dá)，每張切片隨機(jī)選擇5個不同的視野，結(jié)果包括陽性細(xì)胞比例+染色強(qiáng)度。陽性細(xì)胞比例中≤10%計0分，≥11%～25%計1分，≥26%～50%計2分，≥51%～75%計3分，＞75%～100%計4分。染色強(qiáng)度計算中，弱為0分，中為1分，強(qiáng)為2分。結(jié)果0～3分為陰性，≥4分為陽性［3］。而淋巴管密度計數(shù)采用Wendner等［4］方法，先在低倍鏡下觀察切片以確定淋巴管密度最高處，再在高倍鏡下計算D2-40陽性淋巴管數(shù)，采用多功能病理圖像分析儀對標(biāo)本5個視野內(nèi)的淋巴管個數(shù)進(jìn)行計數(shù)，所有5個視野內(nèi)淋巴管的均數(shù)作為該部位的MLVD值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理，資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用q檢驗，其中P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同胃組織中Ang-2、VEGF表達(dá)情況對比

Ang-2、VEGF表達(dá)陽性率在胃癌組織中分別為63.6%(42/66)和54.5%(36/66)，顯著高于癌旁組織的16.7%(3/18)、12.5%(2/18)，及正常組織中的5.6%(1/18)、5.6%(1/18)，P＜0.05。

2.2 胃癌組織中Ang-2、VEGF陽性表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間關(guān)系

胃癌組織中Ang-2、VEGF陽性表達(dá)與TNM分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。TNM分期Ⅰ～Ⅱ的Ang-2、VEGF表達(dá)陽性率顯著低于TNM分期Ⅲ～Ⅳ的患者，P＜0.05;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Ang-2、VEGF表達(dá)陽性率顯著低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，P＜0.05。見表1。

表1 胃癌組織中Ang-2、VEGF表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

2.3 胃癌組織中Ang-2、VEGF的表達(dá)與MLVD之間的相關(guān)性

Ang-2陽性表達(dá)組淋巴管密度平均為(15.32±3.25)個，顯著高于陰性組的(12.65 ± 2.51)個，t=4.053，P＜0.05。而 VEGF陽性表達(dá)組淋巴管密度平均為(15.06±3.17)個，顯著高于陰性組的(12.48±2.49)個，t=3.218，P＜0.05。

3 討論

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響進(jìn)展期胃癌患者預(yù)后的重要因素。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤所獨(dú)有的行為學(xué)特征，是影響惡性腫瘤疾病預(yù)后的重要因素。有多種因子參與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的調(diào)控，本組研究探討血管內(nèi)皮生長因子和血管生成素的促腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作用。

血管生成素(angiopoietins，Ang)是一類分泌型的細(xì)胞因素，主要是由血管內(nèi)皮細(xì)胞所分泌產(chǎn)生，由于其能促進(jìn)血管的生成，故被命名為血管生成素［5］。Ang-2基因位于8p23.1，由496個氨基酸組成，與Ang-1有著60%的同源性，并能夠與受體酪氨酸激酶(Tie2)相結(jié)合［6］。Ang-2能夠競爭性地拮抗Ang-1，能夠通過競爭性抑制Ang-1與Tie2相互作用而參與血管的重塑和血管內(nèi)膜的去穩(wěn)定化，Ang-2正常情況下多分布在子宮、胎盤和卵巢當(dāng)中，可能與這3種組織的血管重建密切相關(guān)［7］。但在病理情況下，Ang-2還能夠表達(dá)于炎癥、創(chuàng)傷以及腫瘤部位，參與血管的重建，其與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)［8］。而遺傳學(xué)表明Ang-2也是淋巴管發(fā)育過程中重要的因子，Ang-2能夠使牛腸系膜淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中Tie2受體磷酸化，從而能夠達(dá)到誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的目的［9］。本組研究顯示，胃癌組織中的Ang-2(63.6%)表達(dá)陽性率顯著高于癌旁組織及正常組織中的表達(dá)，結(jié)果對比有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。在隨后的胃癌組織中Ang-2表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間相關(guān)性研究中顯示，胃癌組織中Ang-2表達(dá)與TNM臨床病理和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，TNM分期Ⅰ～Ⅱ的Ang-2表達(dá)陽性率顯著低于TNM分期Ⅲ～Ⅳ的患者，結(jié)果對比有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Ang-2表達(dá)陽性率顯著低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，結(jié)果對比有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。研究結(jié)果表明Ang-2與腫瘤的惡性程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。此外，本組研究還發(fā)現(xiàn)，Ang-2陽性表達(dá)組淋巴管密度平均為(15.32±3.25)個，顯著高于陰性組的(12.65±2.51)個，結(jié)果對比有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。表明Ang-2在胃癌中能夠促進(jìn)癌周微淋巴管的生成，從而達(dá)到促進(jìn)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的目的，Ang-2與胃癌淋巴管生存密切相關(guān)。

VEGF具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖及誘導(dǎo)血管生成的能力，促進(jìn)微小靜脈通透性增加，與腫瘤的浸潤性生長以及腫瘤血管生存密切相關(guān)［10］。但有研究表明單純阻斷VEGF表達(dá)并不能夠完全地阻斷腫瘤的生長及血管的形成，其原因可能在于腫瘤組織中存在其他的因子與VEGF協(xié)同作用，目前有許多實驗研究表明胃癌組織中的Ang-2與VEGF表達(dá)具有顯著的相關(guān)性［11］。本組研究顯示VEGF在胃癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，且其表達(dá)與胃癌淋巴管的生成密切相關(guān)，其通過促進(jìn)胃癌淋巴管的生成達(dá)到促進(jìn)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的目的，而Ang-2與VEGF表達(dá)是否共同促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展，有待于進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，本組研究認(rèn)為胃癌中Ang-2、VEGF能夠促進(jìn)癌周微淋巴管的生成，從而促進(jìn)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Ang-2、VEGF有望成為預(yù)測淋巴管生成以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。

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