原發(fā)性肝細胞癌組織中P21的亞細胞定位及其意義

易 玲 邱榮元 王松柏 劉崇梅 馮喜華 萬焱鑫 伍小瓊 何生松

原發(fā)性肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上第五大常見惡性腫瘤，在癌癥相關(guān)死亡原因中排名第三。盡管外科手術(shù)及肝移植治療取得了很大進展，但肝癌的預(yù)后仍不樂觀。

P21具有廣泛的細胞周期抑制活性，理論上其與肝癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，然而國內(nèi)外對其預(yù)測價值意見很不一致。目前認識到P21具有不同的功能狀態(tài)，比如抑制細胞增殖與促進細胞增殖，抑制細胞凋亡與促進細胞凋亡。而P21的功能狀態(tài)與亞細胞定位密切相關(guān)。

本課題組前期研究中［1-3］，初步證實當P21定位于細胞質(zhì)，胞質(zhì)型P21促進HepG2細胞增殖、促進細胞周期運行、增強其抗凋亡能力。作為前期項目的延伸，本研究采用免疫組織化學的方法，檢測原發(fā)性肝細胞肝癌組織中P21表達情況及其亞細胞定位，并探討與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2007年2月至2012年9月岳陽市第二人民醫(yī)院、華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院收治的115例肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的肝癌病例資料及手術(shù)切除于病理科存檔的石蠟包埋標本，其中包括同一病例的肝癌組織、癌旁組織、肝硬化組織。115例中，男性81例，女性34例;年齡16～71歲，平均年齡47歲，中位年齡 48歲;腫瘤直徑平均 5.6 cm(1.5～12 cm)。根據(jù) Edmondson-Steiner標準分級:Ⅰ-Ⅱ級 48例(41.74%)Ⅲ-Ⅳ級67例(58.26%)。HBsAg陽性98例(85.21%)。

表1 P21陽性表達與HCC臨床病理特征的關(guān)系

1.2 主要試劑

鼠抗 P21W AF/CIP1單克隆抗體(Neo Markers);SP試劑盒、DAB顯色劑(北京中杉公司)。

1.3 方法

采用SP法，嚴格按照試劑盒操作說明進行P21免疫組化染色，采用檸檬酸高溫高壓法進行抗原修復(fù)，抗體稀釋度為1:200，DBA顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。以PBS和正常血清分別代替一抗與二抗作陰性對照。陽性細胞計數(shù)標準如下:每個位點隨機選取3個高倍鏡視野，平均每高倍鏡陽性細胞＜5% 為“－”，5%～25% 為“+”，26%～50% 為“++”，＞50% 為“+++”。P21W AF/CIP 1陽性染色為胞質(zhì)型或核型，淡黃色、棕黃色或棕褐色，呈顆粒狀或團塊狀。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0軟件包作統(tǒng)計處理。各組陽性表達率差異的比較及與臨床參數(shù)之間關(guān)系采用卡方檢驗;單因素相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)法。多組之間的兩兩比較采用秩和檢驗法，求Hc值，推斷P值范圍。

2 結(jié)果

2.1 P21在肝臟不同組織中的表達

肝硬化組織中P21陽性表達率為10.43%(12/115)，原發(fā)性肝細胞肝癌組織中陽性率為35.65%(41/115)，癌旁組織為38.26%(44/115)，肝癌與癌旁組織相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，肝癌與肝硬化組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，癌旁與肝硬化組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.2 胞質(zhì)型P21在肝臟不同組織中的表達

胞質(zhì)型P21陽性率在癌旁組織中為6.82%(3/44)，在肝硬化組織中為8.33%(1/12)，在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中為75.61%(31/41)。肝癌與癌旁組織及肝硬化組相比，胞質(zhì)型P21陽性表達率的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而癌旁與肝硬化組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.3 胞質(zhì)型P21與肝癌組織臨床特征的相關(guān)性

胞質(zhì)型P21在肝癌組織中Ⅰ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級的陽性率分別為 42.89%(6/14)，92.59%(25/27)，胞質(zhì)P21的陽性表達與腫瘤細胞分化程度明顯負相關(guān)(γ=－0.42，P＜0.01)，胞質(zhì)型 P21 在肝癌組織中無轉(zhuǎn)移及有轉(zhuǎn)移的患者中陽性率分別為73.07%(12/15)，80.00%(19/26)，胞質(zhì) P21與腫瘤轉(zhuǎn)移正相關(guān)(γ=0.27，P＜0.05)，而與年齡、HBSAg、腫瘤直徑無關(guān)(P＞0.05)。見表1。

3 討論

P21是el-Deiry等于1993年發(fā)現(xiàn)的1種能夠被p53轉(zhuǎn)錄激活的基因，編碼分子量為21 kDa的蛋白，因此命名為P21［4］。P21具有眾多蛋白質(zhì)結(jié)合位點，其中某些部位相互重疊，如P21可與細胞周期素(cyclin)、細胞周期素依賴的蛋白酶(CDK)、增殖細胞核抗原(PCNA)、切冬酶原3(Procaspase 3)、MAPK家族分子、鈣調(diào)蛋白等相互作用，此外還有核定位信號(nuclear locational signal，NLS)、核輸出信號(nuclear export signal，NES)，從而影響其亞細胞定位［5］。

P21蛋白最初因其細胞周期抑制活性而為人們所熟知，因而人們將其歸屬為抑癌基因的范疇。目前關(guān)于P21功能的研究，認識到P21涉及到細胞的生長、分化、凋亡、老化。并且，P21具有不同的功能狀態(tài)，比如抑制細胞增殖與促進細胞增殖，抑制細胞凋亡與促進細胞凋亡［6-7］。而P21的功能狀態(tài)與某些位點的磷酸化、亞細胞定位密切相關(guān)［8］。

P21的抑癌功能與其核定位密切相關(guān)，而胞核P21的促進細胞生長及抗凋亡能力在許多細胞的研究中得到證實，如在急性單核細胞性白血?。?］、人乳腺癌［10］、神經(jīng)腫瘤性疾患［11］。

當P21定位于細胞質(zhì)，可與細胞凋亡信號分子相結(jié)合，如與Procaspase 3結(jié)合，阻止Fas介導(dǎo)的凋亡途徑［12-13］，并且通過抑制促凋亡激酶(apoptosis signalregulating kinase 1，Ask1)而使抗凋亡效應(yīng)進一步放大［14］。Tanaka等發(fā)現(xiàn)［15］，胞質(zhì) P21 蛋白可與 Rho 激酶形成復(fù)合體并抑制其激酶活性，導(dǎo)致肌動蛋白應(yīng)力纖維丟失，促進細胞外生性生長。在某些腫瘤性疾患中，也發(fā)現(xiàn)胞核P21蛋白表達與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，其機制可能為胞核P21抑制Rho激酶活性，肌動蛋白應(yīng)力纖維丟失，細胞活動性增強，最終導(dǎo)致腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移［11］。

目前關(guān)于P21的亞細胞定位與肝癌的關(guān)系，研究尚不多見，而關(guān)于P21與肝癌關(guān)系的報道極不一致，在肝癌組織中，P21的表達意義也未取得一致結(jié)論。

為達到上述研究目的，我們曾采用基因定點誘變的方法［1-3］，構(gòu)建了核定位信號突變的P21真核表達載體，轉(zhuǎn)染HepG2細胞，觀察轉(zhuǎn)染的HepG2細胞周期及凋亡率的改變，進一步了解P21亞細胞定位與其功能活性的關(guān)系。

我們通過觀察肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的原發(fā)性肝細胞癌患者，其肝癌組織、癌旁組織、肝硬化組織中P21的表達情況，亞細胞定位分布，結(jié)果顯示 HCC與癌旁肝組織P21的表達無統(tǒng)計學意義，但通過亞細胞定位的分析表明，HCC主要表達在細胞質(zhì)，其比例可達到75.61%，而癌旁肝組織胞質(zhì)表達比例為6.82%。進一步根據(jù)肝癌組織的腫瘤細胞分化程度及腫瘤轉(zhuǎn)移情況進行相關(guān)性分析，胞質(zhì)P21的陽性表達與腫瘤細胞分化程度明顯負相關(guān)，胞質(zhì)型P21的陽性表達與腫瘤轉(zhuǎn)移正相關(guān)。

本組研究表明，在肝硬化組織中，由于炎癥和纖維化影響，P21表達上調(diào)，但主要定位于細胞核，其表達率與炎癥及纖維化程度密切相關(guān)。而在肝癌組織，P21也可見表達上調(diào)，但主要定位于細胞質(zhì)，而且胞質(zhì)表達的比例與腫瘤分化程度、腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，細胞質(zhì)P21的高表達，可能有助于原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展。雖然P21具有廣泛的細胞周期抑制活性，但既往以P21為靶點的抗腫瘤治療，并沒有取得令人鼓舞的臨床效果，考慮可能與忽視了P21蛋白的功能狀態(tài)與其亞細胞定位密切相關(guān)，因此，從亞細胞定位角度，調(diào)整P21的抗腫瘤治療策略，也許是條可行的途徑。

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