弓形蟲棒狀體蛋白18的原核表達(dá)及鑒定

鞠愛萍，吳亮，沈進(jìn)，李禮，姜旭淦，陳盛霞

(江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種廣泛分布于世界范圍內(nèi)的重要的人獸共患寄生蟲，幾乎感染所有的恒溫動(dòng)物，人類普遍易感，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球約有1/3人口感染弓形蟲［1］。免疫功能正常人群感染弓形蟲后不會(huì)出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，僅表現(xiàn)為輕度流感樣癥狀，但免疫功能降低、缺陷者或胎兒感染后則可引發(fā)嚴(yán)重的弓形蟲病，從而導(dǎo)致人體各器官出現(xiàn)嚴(yán)重病變，新生兒腦炎、智力障礙，甚至流產(chǎn)、畸胎、死胎［2］。目前弓形蟲感染已成為AIDS患者和器官移植者重要的死亡因素之一［3］。弓形蟲棒狀體蛋白(rhoptry proteins，ROPs)是棒狀體分泌的一系列毒力蛋白，是弓形蟲入侵宿主的重要作用因子［4－5］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)弓形蟲棒狀體蛋白的研究取得了一定進(jìn)展，證明 ROP18是一個(gè)毒力關(guān)鍵因子，對(duì)于弓形蟲入侵宿主細(xì)胞及其在細(xì)胞內(nèi)的生存是十分重要的［6］，而國內(nèi)對(duì)ROP18的研究較少。本研究通過原核表達(dá)技術(shù)成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體并獲得重組ROP18，為深入研究ROP18的生物學(xué)功能及其在入侵中發(fā)揮的作用提供了幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與蟲株 HeLa細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。弓形蟲RH株由本室液氮冷凍保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 家兔，2.0 kg，雄性，購自江蘇省江陵動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，清潔級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.1.3 菌株與質(zhì)粒 大腸埃希菌(E.coli)DH5α株和Rosetta株及原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)均由本實(shí)驗(yàn)室保存，pTG19-T載體購自上海捷瑞生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 試劑與儀器 總RNA提取試劑盒、2×PCR預(yù)混液、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、牛血清白蛋白、DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物、異丙基-D-硫代半乳糖苷均購自上海捷瑞生物技術(shù)有限公司，限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和HindⅢ購自立陶宛 Fermentas公司，T4連接酶購自寶生物大連有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(HRP-IgG)、FITC標(biāo)記羊抗兔IgG、硝酸纖維素膜NC膜和ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒均購自武漢博士德公司，低聚甲醛、Triton X-100、福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑以及4，6-二脒基-2-苯基吲哚均購自美國Sigma公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。全自動(dòng)凝膠成像儀及垂直電泳儀購自美國Bio-Rad公司，超聲破碎儀購自北京迪索儀器有限公司，核酸蛋白分析儀購自英國WPA公司，溫控?fù)u床4YC-200購自上海?，敼?，脫色搖床購自金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 弓形蟲的培養(yǎng)及總RNA提取 按吳亮等［7］報(bào)道的方法在HeLa細(xì)胞中傳代培養(yǎng)弓形蟲RH株速殖子。從液氮取出凍存的弓形蟲 RH株，37℃水浴快速復(fù)蘇，3 000 r/min離心5 min，用l%胎牛血清RPMI 1640重懸后接種HeLa細(xì)胞，置37℃ 5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞和蟲體的生長狀態(tài)，鏡下觀察到大量蟲體游離于細(xì)胞外時(shí)收集蟲體，以滅菌PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌3次，按照RNA提取試劑盒說明書抽提弓形蟲速殖子總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ROP18基因擴(kuò)增與克隆 根據(jù)ToxoDB基因庫中弓形蟲RH株基因組ROP18基因序列，用DNASTAR軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物。上游引物ROP18-F:5'-GGCGGATCCATGTTTTCGGTACAGCGGCCACCTCTTA-3'(BamHⅠ)，下游引物 ROP18-R:5'-GGCAAGCTTTTATTCTGTGTGGAGATGTTCC TGC TGTTC-3'(HindⅢ)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以弓形蟲cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性1 min，94℃ 5 s，63.1℃ 90 s，72 ℃ 90 s，25 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定分析正確后，膠回收試劑盒回收 PCR產(chǎn)物，與克隆載體pTG19-T 4℃連接12 h后轉(zhuǎn)化至感受態(tài) DH5α，涂布于含100 μg/mL氨芐西林、200 μg/mL X-Gal和 100 μg/mL IPTG 的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜，次日經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落轉(zhuǎn)入液體LB培養(yǎng)基增菌，按堿裂解法提取重組質(zhì)粒。

1.2.3 重組質(zhì)粒ROP18/pTG19-T鑒定 提取的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和BamHⅠ酶切鑒定，陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，基因測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)分析，與基因庫中弓形蟲ROP18編碼基因完全一致后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 ROP18/pET-28a(+)表達(dá)載體構(gòu)建 重組質(zhì)粒ROP18/pTG19-T和表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)分別經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后膠回收，經(jīng)T4連接酶16℃過夜連接后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，按堿裂解法提取質(zhì)粒，將重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosetta感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.5 重組蛋白表達(dá) 挑取陽性菌落接種于3 mL含卡那青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250 r/min振搖培養(yǎng)過夜;次日以1∶100比例接種含同種抗生素的200 mL LB培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)約2 h，直至光密度(D)值為0.6左右，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，30℃ 250 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，收集菌體，洗滌后加入包涵體結(jié)合緩沖液，充分重懸菌體，靜置30 min后超聲裂解菌體，4℃ 15 000 r/min離心30 min，收集上清液。

1.2.6 重組蛋白純化 根據(jù)目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小配制分離膠，不插樣品梳直接上樣，SDSPAGE電泳參照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行，直到溴酚藍(lán)染料抵達(dá)分離膠底部時(shí)結(jié)束電泳。將膠塊取下置于預(yù)冷KCl(250 mmol/L)溶液中，振搖染色10 min，膠塊上可呈現(xiàn)一條白色的目的蛋白條帶，將此條帶切下置于PBS緩沖液中振搖洗滌5 min。根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步處理膠條:用于制備多克隆抗體時(shí)，將膠條與適量佐劑混合后于冰上充分研磨粉碎，形成“油包水”狀即可免疫家兔;ELISA實(shí)驗(yàn)包被抗原時(shí)，將膠條置于EP管中，加入少許PBS緩沖液振蕩混勻，－20℃反復(fù)凍溶3次，4℃ 16 400 r/min離心15 min，取上清液即為ELISA實(shí)驗(yàn)的包被抗原。

1.2.7 兔抗重組蛋白R(shí)OP18多克隆抗體制備 按姜旭淦等［9］報(bào)道方法進(jìn)行。制備足量乳化抗原，經(jīng)背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射法免疫家兔，初次免疫前采集兔耳緣靜脈血液，取血清作陰性對(duì)照，第1次免疫3周后，進(jìn)行第2次免疫，間隔1周進(jìn)行第3次加強(qiáng)免疫，共免疫3次，劑量及免疫途徑同首次免疫。加強(qiáng)免疫1周后經(jīng)耳緣靜脈采集兔血，分離血清，以ELISA法檢測(cè)其血清抗體效價(jià)，當(dāng)抗體效價(jià)＞1∶51 200時(shí)，即可采用心臟采血法收集兔血，分離血清，此即兔多克隆抗體，分裝后于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)ROP18在弓形蟲速殖子中的表達(dá) HeLa細(xì)胞中傳代培養(yǎng)弓形蟲RH株速殖子，收集1×107蟲體于EP管中，加SDS-PAGE上樣緩沖液，充分混勻后煮沸10 min，4℃ 16 400 r/min離心20 min，取上清液上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將目的蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1∶1 000兔抗ROP18抗血清，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次后，與1∶5 000 HRP標(biāo)記羊抗兔IgG室溫孵育1 h，充分洗滌后進(jìn)行ECL顯影反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光儀觀察結(jié)果。

1.2.9 間接免疫熒光(IFA)觀察ROP18在弓形蟲速殖子中的分布 在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)放置1塊干凈蓋玻片，無菌操作接種 2.5×105個(gè)/孔HeLa細(xì)胞，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鏡下觀察細(xì)胞生長融合至80%時(shí)，接種弓形蟲速殖子1×106個(gè)/孔，繼續(xù)置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，共培養(yǎng)至4 h時(shí)取出蓋玻片，以PBS緩沖液振搖洗滌3次，4%低聚甲醛室溫固定15 min，經(jīng)0.25%Triton X-100透化處理15 min后，5%BSA室溫封閉1 h，滴加兔抗ROP18抗血清(1∶1 000)37℃孵育2 h，PBS緩沖液振搖洗滌3次，加FITC-IgG(1∶100)37℃孵育1 h，洗滌3次后加入適當(dāng)濃度的DAPI溶液復(fù)染，洗滌后以抗熒光淬滅封片劑封片，立即置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 弓形蟲ROP18基因體外擴(kuò)增結(jié)果

以弓形蟲 cDNA為模板，PCR擴(kuò)增弓形蟲ROP18基因，其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，片段大小約1 665 bp(圖1)，與弓形蟲ROP18基因理論擴(kuò)增片段大小相符。

圖1 PCR擴(kuò)增弓形蟲ROP18基因結(jié)果Fig 1 Amplification of ROP18 gene in T.gondii by PCR

2.2 ROP18/pET-28a(+)重組質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒ROP18/pET-28a(+)經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切得到約1 665 bp和5 369 bp片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)，證明ROP18基因被完整插入表達(dá)載體pET-28a(+)中。

圖2 ROP18/pET28a(+)重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig 2 Identification of ROP18/pET28a(+)by restriction enzyme digestion

2.3 重組蛋白R(shí)OP18表達(dá)純化

重組蛋白主要以包涵體形式存在，經(jīng) KCl染色(圖3)，可見相對(duì)分子質(zhì)量67×103處有目的蛋白表達(dá)帶，與ROP18蛋白理論預(yù)測(cè)值大小一致。采用切膠法純化蛋白，將目的蛋白條帶切下，經(jīng)SDSPAGE電泳檢測(cè)分析，可見67×103處一條目的蛋白回收帶 (圖4)，此即為純化的目的蛋白。

2.4 弓形蟲速殖子ROP18的表達(dá)

經(jīng)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，免疫兔血清能識(shí)別相對(duì)分子質(zhì)量為 55×103的反應(yīng)條帶(圖 5)，與ROP18相對(duì)分子質(zhì)量值相符，表明采用KCl染色切膠法純化蛋白方法可行，并且制備的兔多克隆抗體特異性較好。

2.5 弓形蟲速殖子ROP18的分布

熒光顯微鏡下觀察到ROP18蛋白的綠色熒光分布于弓形蟲速殖子細(xì)胞核前端，與棒狀體位置一致，與細(xì)胞核藍(lán)色熒光不重合，A、B融合圖可以清楚地定位ROP18蛋白在蟲體內(nèi)的分布(圖 6)。

圖3 重組ROP18蛋白KCl染色Fig 3 Recombinant ROP18 by KCl stain

圖4 重組ROP18蛋白純化結(jié)果SDS-PAGE分析Fig 4 Purification of recombinant ROP18 by SDS-PAGE analysis

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)弓形蟲速殖子ROP18表達(dá)Fig 5 Western blotting analysis of ROP18 expression in T.gondii

圖6 IFA檢測(cè)弓形蟲速殖子ROP18蛋白表達(dá)(×1 000)Fig 6 ROP18 expression in T.gondii tachyzoites by IFA

3 討論

弓形蟲ROP18是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有激酶活性，是弓形蟲的關(guān)鍵毒力因子［10－11］。對(duì)ROP18進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，它和ROP2家族中的另一成員ROP5最接近，有28%的同源性，和ROP2有25%的同源性［6］，在RH株蟲體中可以大量表達(dá)，相對(duì)分子質(zhì)量約為55×103。已有研究發(fā)現(xiàn)，ROP18定位于弓形蟲納蟲泡膜(parasitophorous vacuole membrane，PVM)［12］，宿主體內(nèi) γ 干擾素可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫相關(guān)GTP酶(IRGs)因子，其中IRG6因子可自動(dòng)聚積于PVM上，造成PVM損害，使蟲體失去保護(hù)膜，從而使得機(jī)體免疫系統(tǒng)殺死PVM中的蟲體［13］。而ROP18可與IRG6結(jié)合，使其磷酸化而喪失活性，不能聚積于PVM上，無法破壞弓形蟲周圍的保護(hù)膜，從而使蟲體逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除，保護(hù)PVM中蟲體存活并正常生長繁殖［14］。

本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)，成功獲得了重組弓形蟲ROP18，經(jīng)純化后免疫家兔，制備了抗ROP18多克隆抗體;采用IFA和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)了ROP18在蟲體中的分布和表達(dá)，為進(jìn)一步研究ROP18在弓形蟲入侵及生長繁殖中的作用提供了技術(shù)支撐。

本研究中對(duì)于表達(dá)的包涵體蛋白純化方法，起初使用常規(guī)的Ni-NTA親和層析法，但出現(xiàn)目的蛋白與Ni-NTA層析柱不結(jié)合的情況，造成目的蛋白的大量丟失，不能很好地純化目的蛋白。本研究通過KCl染色切膠法純化蛋白，獲得了高濃度的目的蛋白，并成功免疫家兔，制備了相應(yīng)的抗ROP18多克隆抗體，經(jīng)ELISA技術(shù)檢測(cè)證實(shí)此抗體具有較高的滴度;應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)可以驗(yàn)證在55×103處有特異性條帶。以上結(jié)果表明，通過KCl染色切膠法回收的ROP18蛋白仍保留天然蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，從而保持了ROP18蛋白的抗原性。與傳統(tǒng)的純化包涵體蛋白方法相比，KCl染色切膠純化法具有以下優(yōu)點(diǎn)，①簡單易行:實(shí)驗(yàn)步驟簡單，避免了多次洗脫親和層析柱的繁瑣工作;② 經(jīng)濟(jì)實(shí)用:所用試劑數(shù)量少且普通，易得便宜，降低了實(shí)驗(yàn)成本;③快速省時(shí):實(shí)驗(yàn)時(shí)間明顯縮短，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。但不適用于純化表達(dá)量較低的蛋白。KCl染色切膠免疫方法的應(yīng)用為包涵體形式存在蛋白的多克隆抗體制備提供了一種便利方法，所分離的蛋白純度高、量大，不僅為進(jìn)一步研究蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)分析提供了技術(shù)支持;而且在乳化抗原中可以緩慢釋放抗原，有效發(fā)揮免疫佐劑的作用［15－16］。有研究已證實(shí)切膠免疫還能滿足單克隆抗體制備的要求［17－18］。因此，KCl染色切膠回收蛋白是一種可行的方案，值得應(yīng)用推廣。

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