豬流行性腹瀉病毒的分離及RT-PCR方法的建立

田 野，蘇丹萍，鐘 望，張顯浩，張海明，陳瑞愛,，賀東生*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 廣東省人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；2.廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司，廣東 新興 527400）

豬流行性腹瀉屬于冠狀病毒成員，為有囊膜的單股正鏈RNA 病毒，以腹瀉、嘔吐、脫水和對(duì)哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病[1]。在1971 年比利時(shí)和英國(guó)，該病毒被首次報(bào)道，之后在很多養(yǎng)豬國(guó)家都暴發(fā)了該病，特別是歐洲和亞洲[2]。我國(guó)從1976 年開始陸續(xù)有PED 的報(bào)道,20世紀(jì)80 年代后該病在中國(guó)流行面逐漸擴(kuò)大,并多與豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒等其他腸道病原混合感染,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[3]。

近幾年我國(guó)的廣東、廣西、江西、湖南、福建、浙江、安徽、江蘇、湖北、河北和山東、東北等?。ㄗ灾螀^(qū)）的部分地區(qū)，泰國(guó)、菲律賓、韓國(guó)等亞洲國(guó)家的規(guī)模化豬場(chǎng)發(fā)生嚴(yán)重的腹瀉病例。在我國(guó)2011 年和2012 年形成兩波豬腹瀉病大流行。仔豬腹瀉的病原是復(fù)雜多樣的，根據(jù)對(duì)18 個(gè)大型豬場(chǎng)的抽樣檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)2012 年豬腹瀉主要病原是豬流行性腹瀉病毒。分離病毒，并建立穩(wěn)定的檢測(cè)手段，是能更好地防控和研究該病毒的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料、試劑盒載體

2012 年2 月份，從華南地區(qū)某大型豬場(chǎng)采集疑似豬流行性腹瀉病料-小腸和肛拭紙。病毒RNA 的提取用經(jīng)典的Trizol 法。MLV、RRI、dNTPs、rTaq購(gòu)自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Genbank 上登錄的CV777 序列設(shè)計(jì)了1 對(duì)針對(duì)M 基因的特異性引物，Pm1：5'-TGCTTCAGTATGGC CATTACAAGTACTCTG-3'，Pm2：5'-CCTGTCGGCCCATCACAGAAG

TAGT-3'，用于檢測(cè)PEDV。以上引物采用PrimerSelect 5.0 軟件設(shè)計(jì)，由Invitrogen 上海生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 組織病料PEDV 的RT-PCR檢測(cè)及病毒分離

取少量小腸病料，加入1 mol 雙抗，用研磨器進(jìn)行研磨。將研磨好的組織懸液放入干凈的1.5 mL 離心管中，反復(fù)凍融3 次，5 000 r/min 離心3 min。去250μL 病料上清用Trizol 法抽提組織總RNA。根據(jù)MLV 的說明，取1μLRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，之后產(chǎn)生的cDNA 進(jìn)行PCR 檢測(cè)。PCR 反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液2.5μL、25μmol/L Pm1 1μL、25μmol/L Pm2 1μL、10 mmol/L dNTP Mix 4μL、rTaq 0.25μL， 滅菌ddH2O 補(bǔ)足至25μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個(gè) 循 環(huán)，最后72 ℃延 伸10 min。PCR 產(chǎn) 物 用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

將陽性病料反復(fù)凍融3 次，過濾膜，接種到vero 細(xì)胞，吸附2 h。棄掉毒液，加入含55μg/mL 的DMEM（不含血清），培養(yǎng)72 h，收毒。用同樣的方法，傳到第15 代時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變。

1.4 RT-PCR 方法特異性的檢測(cè)

選取臨床上有腹瀉癥狀的其他病毒，如豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒、豬瘟、偽狂犬病病毒等，檢測(cè)該RT-PCR 方法的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞病變

病毒在接種vero 細(xì)胞前，先與含終濃度55μg/mL 胰蛋白酶的無血清DMEM 作用幾分鐘，然后接種到vero細(xì)胞上，加入含終濃度45μg/mL 胰蛋白酶的無血清DMEM 維持液，72 h 后收取病毒液。在前10 代細(xì)胞病變不明顯，隨著代數(shù)的增多細(xì)胞病變逐漸典型。連續(xù)傳代至第15 代，在vero 細(xì)胞上出現(xiàn)典型的空泡狀病變（如圖1）。且傳代后PCR 可以檢測(cè)到病毒（如圖2）。

圖1 第15 代PEDV 出現(xiàn)空泡狀的細(xì)胞病變

2.2 RT-PCR 方法特異性檢測(cè)

根據(jù)臨床癥狀很難區(qū)分豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎和輪狀病毒，因?yàn)樗鼈冎饕∽兌际鞘鼓c壁變薄，從而引起消化不良性的腹瀉。PCR 方法優(yōu)點(diǎn)就是特異性好，能夠區(qū)分不同的病原。為了檢測(cè)RT-PCR 的特異性，選取4種臨床上能出現(xiàn)腹瀉癥狀的病毒（豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒、豬瘟病毒和偽狂犬病病毒），做PCR 檢測(cè)，結(jié)果RT-PCR 的特異性高（如圖3）。

2.3 細(xì)胞毒不同代次的檢測(cè)

分離豬流行性腹瀉病毒很困難，它很難在現(xiàn)有的傳代細(xì)胞上出現(xiàn)細(xì)胞病變，病毒需要胰蛋白酶的作用才能侵入細(xì)胞。在分離病毒前幾代不會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞病變，通過PCR 檢測(cè)成了確認(rèn)病毒存在的主要手段。

豬流行性腹瀉病毒是近幾年造成仔豬腹瀉的主要病原之一。由于病毒很難在現(xiàn)有的細(xì)胞系中增殖和出現(xiàn)細(xì)胞病變，病毒分離很難，從而對(duì)它的研究比較滯后。能成功的分離該病毒，為研究它提供了基礎(chǔ)作用。另一方面在臨床上造成腹瀉的病原較多，建立一個(gè)穩(wěn)定成熟的PCR 方法成了當(dāng)務(wù)之急。豬流行性腹瀉病毒的M 基因非常保守，針對(duì)M 基因設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，通過檢測(cè)可知，PCR 方法特異性非常好。

[1] Pensaert M B, Debouck P. A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine[J]. Arch Virol,1978,58(3):243-247.

[2] Kweon C H , Kwon B J, Jung T S, et al.Korean J Vet Rec 33[M].1993:249-254.

[3] 倪艷秀, 林繼煌, 何孔旺, 等. 豬流行性腹瀉研究概況[J].畜牧與獸醫(yī),2001, 33(1): 38-40.