食積因素對FM1流感病毒感染小鼠免疫功能影響的實驗研究

施金鳳 于 河 王 上 谷曉紅

(1河南省鄭州市第二中醫(yī)院，鄭州，450002;2北京中醫(yī)藥大學，北京，100029;3湖北中醫(yī)藥大學，武漢，430061)

小兒臟腑嬌嫩，形氣未充，肺脾常不足，且寒暖不能自調，乳食不知自節(jié)易于形成食積，外易受六淫所侵而發(fā)病，臨床多以呼吸系統為多[1]。加之小兒體屬“純陽”，呼吸道黏膜防御機制不夠完善，故感邪易從熱化而成急性外感熱病。中醫(yī)學認為積食積熱可促進肺熱證的發(fā)生、發(fā)展，如葉天士所言:“胃腸為市，故陽明為成溫之藪也”。臨床發(fā)現，食積小兒容易發(fā)生急性呼吸系統感染，而具體病理機制尚待進一步發(fā)掘探索。有研究發(fā)現流感病毒感染與機體免疫功能失調有密切關系[2]，而細胞因子在感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。有學者認為T輔助淋巴細胞TH1/TH2的功能可以反應機體促炎和抗炎反應的失衡情況[3]。TH1細胞主要分泌干擾素γ，TH2細胞則主要分泌IL－4，本研究試圖從TH1(IFN－γ)和TH2(IL－4)平衡的角度來探討食積因素在病毒感染狀態(tài)下細胞因子譜的改變，以明確其對機體免疫功能的影響。嘗試揭示食積影響肺系熱證的發(fā)展變化的作用機制，為臨床肺胃同治提供依據，對于急性呼吸系統傳染病的防治有一定指導意義。

1 材料與方法

1.1 動物分組 昆明小鼠，雄性，體重11～13 g，180只，清潔級，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2006－0009]。購入后置免疫教研室動物房實驗動物潔凈柜飼養(yǎng)。將小鼠按體重隨機分為3組:正常組、單純感染組、食積感染組，每組60只。

1.2 模型制作 正常組:正常飼料，不限食水。從實驗第1天起，予生理鹽水按0.2 mL/10 g灌胃，2次/d，共灌胃4 d。于第5天乙醚麻醉后，給予生理鹽水50 μL滴鼻。單純感染組:正常飼料，不限食水。從實驗第1天起，予生理鹽水按0.2 mL/10 g灌胃，2次/d，共灌胃4 d。于第5天乙醚麻醉后，予FM1流感病毒50 μL滴鼻。食積感染組:自制高蛋白、高熱量飼料(豆粉、面粉、牛奶粉、魚肉松，四者按2∶1∶1∶1 比例配制)，不限食水。從實驗第1天起，予52%濃度的牛乳按0.2 mL/10 g灌胃，2次/d，共灌胃4 d。于第5天乙醚麻醉后，予流感病毒50 μL滴鼻。

1.3 主要試劑及藥物 免疫球蛋白M酶聯免疫試劑盒IgM(201103)ELISA;白介素4酶聯免疫試劑盒IL－4(201102)ELISA、干擾素γ酶聯免疫試劑盒IFN－γ(201102)ELISA IT:北京康源瑞得生物技術有限公司提供;病毒:流感病毒亞洲甲型鼠肺適應株(FM1)由北京中醫(yī)藥大學免疫學教研室提供，LD50為10－3.7，4LD50的流感病毒液為1∶150;乙醚、乙醇、生理鹽水。

1.4 觀察項目 1)小鼠體征;2)體重:從實驗第1天開始，連續(xù)記錄小鼠體重，至取材前;3)正常組與單純感染組、單純感染組分別在感染病毒后第1、3、5天，各組每次取20只小鼠，摘眼球取血，其中每組中的10只，靜置后低溫離心(1000 r/min)，離心15 min，留取血清，將血清置于－80℃冰箱中備用，行酶聯免疫分析法(ELISA)測各組小鼠血清IL－4、IFN－γ含量;每組中另外的10只，靜置后低溫離心(3000 r/min)，離心10 min，留取血清，將血清置于－80℃冰箱中備用，行酶聯免疫分析法(ELISA)測各組小鼠血清特異性抗體IgM含量。

1.5 統計學分析 采用SPSS13.0統計軟件處理數據，各組數據均值以±s表示，進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 小鼠體征 正常組小鼠糞便質粗，量多，未見明顯異常。單純感染組小鼠活動減少，扎堆，聳毛，毛無光澤，蜷縮，活動減少，糞便質粗，量多;食積感染組小鼠活動減少，扎堆，蜷縮，眼睛分泌物多，睜眼受限，毛色發(fā)黃結成束狀，較臟，糞便呈黃棕色、質細，量較少，較硬。

2.2 血清IgM含量、IFN－γ、IL－4、TH1/TH2水平

2.2.1 小鼠血清IgM 結果顯示，小鼠感染FM1病毒后第1、3天，單純感染組較正常組小鼠血清IgM升高，有統計學意義(P＜0.01);食積感染組較正常組IgM水平升高，但結果無統計學意義(P＞0.05);食積感染組水平較單純感染組降低，但結果無統計學意義(P＞0.05)。小鼠感染FM1病毒后第5天，單純感染組、食積感染組小鼠均較正常組小鼠血清IgM含量下降，且食積感染組結果差異有統計學意義(P＜0.05)，食積感染組較單純感染組、正常組小鼠血清IgM含量明顯降低，且結果有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

表1 小鼠血清IgM(μg/mL) (±s)

表1 小鼠血清IgM(μg/mL) (±s)

注:與同天正常組相比，*P＜0.01;與同天單純感染組相比，△△P＜0.01。

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2.2.2 細胞因子水平

2.2.2.1 小鼠血清IL－4變化 小鼠感染FM1病毒后第1、3、5天，單純感染組、食積感染組小鼠血清IL－4水平均較正常組升高，且食積感染組結果有統計學意義(P＜0.01)，單純感染組與正常組比較第3天結果差異顯著(P＞0.05)，食積感染組小鼠較單純感染組升高，且在第1、5天時結果有統計學意義(P＜0.01)，見表2。

表2 小鼠血清IL－4(pg/mL)(±s)

表2 小鼠血清IL－4(pg/mL)(±s)

注:與同天正常組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與同天單純感染組相比，△△P ＜0.01。

10 10 10正常組 202.260±35.6481 203.907±29.1355 225.121±39.0966單純感染組 203.640±28.9521 240.159±36.4371* 226.438±54.7801食積感染組244.844±22.3894＊＊△△ 249.052±49.2737＊＊ 367.107±59.7842 1 d 3 d 5 d鼠數時間＊＊△△

2.2.2.2 小鼠血清IFN－γ變化 小鼠感染FM1病毒后第1天，單純感染組、食積感染組小鼠血清IFN－γ均較正常組升高，但差異無統計學意義(P＞0.05);于感染后第3、5天，單純感染組及食積感染組均較正常組下降，且在第5天下降明顯差異有統計學意義(P＜0.01)，食積感染組較單純感染組下降更為明顯，但差異無統計學意義(P＞0.05)，見表3。

表3 小鼠血清IFN－γ(pg/mL)(±s)

表3 小鼠血清IFN－γ(pg/mL)(±s)

注:與同天正常組相比，＊＊P＜0.01。

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2.2.2.3 小鼠血清TH1/TH2變化 小鼠感染FM1病毒后第1、3、5天，單純感染組、食積感染組均較正常組降低，且在第3天差異有統計學意義(P＜0.05)，而在第3、5天食積感染組較正常組降低更為明顯，且差異有統計學意義(P＜0.05);食積感染組在不同時相雖均較單純感染組下降，但差異無統計學意義(P＞0.05)，見表4。

表4 小鼠血清TH1/TH2(±s)

表4 小鼠血清TH1/TH2(±s)

注:與同天正常組相比，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

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3 討論

基于小兒特殊的生理病理特點，使得小兒易發(fā)生食積，并表現出病理狀態(tài)，從而引發(fā)各種相關疾病。已有研究證實，食積可導致腸源性內毒素血癥及肺損傷等[4]，隨著食積實驗研究不斷深入，食積不僅對血生化、胃腸功能的改變產生了影響，而且對免疫功能也有作用。畢可恩等通過對食積狀態(tài)下小鼠免疫功能的測定發(fā)現，非特異性免疫的巨噬細胞吞噬功能、細胞免疫的遲發(fā)性變態(tài)反應試驗、體液免疫的血清溶血素測定等免疫指標，食積組明顯低于正常組，推測免疫功能的改變可能是食積患兒易于反復感染外邪的內在病理基礎[5]。流感病毒經由呼吸道侵入機體后不僅能在呼吸道的細胞內增殖，導致呼吸道各類細胞變性、壞死，病毒顆粒尚可穿過呼吸道黏膜，引起進行性感染，導致淋巴細胞、單核細胞及多核細胞生長特性改變、功能降低甚至溶解、凋亡，從而導致機體免疫功能降低[6]。病毒可激活小鼠的免疫細胞產生氧自由基、NO和大量細胞因子，而這些因子作為免疫介質介導的全身病理反應導致小鼠發(fā)病[7]，并造成免疫器官損傷和功能下降。免疫球蛋白是具有抗體活性或化學結構上與抗體相似的球蛋白，是一類重要的免疫效應分子，經抗原誘導可轉化為抗體，IgM就是其中的一種，其主要參與機體的體液免疫調節(jié)，主要作用是與抗原發(fā)生免疫反應，生成抗原－抗體復合物，從而阻斷病原體對機體的危害。機體在病毒、細菌等感染后，抗原刺激誘導體液免疫應答過程中，IgM產生時間最早，血清中以IgM為代表，形成對付外源性微生物或病毒侵入的第一道防線[8]。本實驗中，在小鼠感染FM1病毒后第5天，血清IgM含量食積感染組較正常組及單純感染組均下降，說明食積小鼠感染FM1病毒感染后，機體體液免疫能力明顯下降，這與黎交清等[9]報道的小兒感染的IgM指標有所下降是一致的。而單純感染組小鼠IgM水平較正常組降低，這與國內報道也是一致的[10－11]。小鼠在感染FM1病毒后第1、3天，單純感染組及食積感染組小鼠血清IgM含量均較正常組升高，可能與淋巴細胞迅速增殖，從而產生較多的IgM積極參與機體的體液免疫應答，阻斷病毒對機體的危害有關。而食積感染組小鼠血清IgM水平較單純感染組下降明顯，可能與陽明積熱本身已經對機體的體液免疫能力產生了影響，導致機體的抗感染能力下降，一旦受到病毒的侵襲后，導致機體IgM濃度出現明顯降低，進一步影響機體免疫能力及抗感染能力，這與報道的感染期間的細胞免疫功能和補體系統功能相對減弱，機體抗感染能力隨之下降也是一致的[12]，食積通過調節(jié)機體體液免疫影響了機體IgM的含量，從而導致機體抗感染能力下降。

干擾素(IFN)是一種廣泛的抗病毒物質，是機體抗病毒感染中最重要的細胞因子之一，在病毒性疾病的康復中有重要地位[13]。有實驗研究發(fā)現，病毒感染小鼠后，模型組IFN－γ水平較正常組明顯降低，說明流感病毒感染導致機體的細胞免疫功能減弱，對免疫系統產生了抑制作用。流感病毒經抗原遞呈后活化CD4+T細胞，活化的CD4+Th細胞分泌多種細胞因子，可分化為Th1，Th2兩個亞類，正常狀態(tài)下，TH1/TH2通過分泌細胞因子彼此調節(jié)，相互制約，相對平衡，以維持正常免疫狀態(tài)。本實驗中，病毒感染后，小鼠血清IFN－γ/IL－4水平，單純感染組、食積感染組均較正常組下降，尤其在病毒感染后的第3、5天降低較為明顯，食積感染組降低更為明顯，食積感染組小鼠TH1/TH2水平較正常組及單純感染組降低，說明病毒感染引起了機體抗炎與促炎水平的失衡，從而導致了機體免疫功能的紊亂，且食積感染組對機體免疫失衡的影響更為明顯。食積感染組較單純感染組小鼠血清IFN－γ/IL－4水平有下降趨勢，但其對機體免疫失衡的影響是否更為嚴重仍需進一步論證。因此，食積因素可能通過影響機體IgM產生、IFN－γ、IL－4細胞因子水平，導致機體免疫系統發(fā)生失調，從而對機體免疫功能產生了影響，說明食積可能與對肺熱證的發(fā)生、發(fā)展存在一定相關性。因此，食積因素可能通過影響小兒機體免疫功能，從而使小兒易于發(fā)生呼吸系統感染，本研究提示及時消除食積內因，對于呼吸系統感染性疾病易感人群可以起到防護的目的。

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