白鶴靈芝中傘形花內(nèi)酯的HPLC法測定

謝麗莎,龔志強(qiáng),黃振園,蒙田秀

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院,中國 南寧 530222)

白鶴靈芝又名癬草[1]、仙鶴草[2]、仙鶴靈芝草．學(xué)名Rhinacanthusnasutus(L.) Lindau，來自爵床科白鶴靈芝屬植物白鶴靈芝的干燥枝或葉，其味甘、性溫，為我國傳統(tǒng)應(yīng)用的中藥．具有潤肺止咳、平喘祛痰、清熱疏肝、利濕止癢、收斂止血等功效,用于治療肺熱燥咳、肺結(jié)核及受到風(fēng)寒時所產(chǎn)生的咳嗽等癥[3-4]．主要分布于我國福建、廣東、廣西、云南、臺灣等地，此外，泰國、印度等東南亞國家也有使用[5]．全世界的白鶴靈芝約有15種，而中國僅1種[6]．我國臺灣地區(qū)將其作為青春茶之寶，食療養(yǎng)生、裨益身體，且無副作用．白鶴靈芝泡茶飲，對高血壓特別是老年性高血壓、糖尿病、動脈硬化、失眠、便秘以及婦女生理調(diào)節(jié)等頑癥具有神奇療效[5-7]．本文采用HPLC法建立了白鶴靈芝藥材中傘形花內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定方法，為白鶴靈芝藥材的質(zhì)量評價和進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)．

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈(色譜純，美國TEDIA)、甲醇(分析純，北京化工廠)、超純水(杭州娃哈哈)、磷酸等其他試劑均為分析純；4批采收自不同地區(qū)的白鶴靈芝(表1)，3批采收時間不同的廣西南寧種植白鶴靈芝(表2)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)劉壽養(yǎng)副教授鑒定為爵床科白鶴靈芝屬白鶴靈芝Rhinacanthusnasutus(L.)Lindau干燥葉, 陰干、粉碎過0.354 mm篩．

Agilent1200高效液相色譜儀(DAD檢測器，美國安捷倫)；LG-16W 高速微量離心機(jī)(北京京立)、KQ-5000E醫(yī)用超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)、BP211D 電子分析天平(德國賽多利斯)．

表1 不同來源白鶴靈芝根產(chǎn)地及采收時間

表2 廣西南寧種植不同生長年限白鶴靈芝

對照品：傘形花內(nèi)酯對照品為本實驗室自制，通過解析其MS、1H NMR及13C NMR數(shù)據(jù)，與文獻(xiàn)[8-11]報道的結(jié)構(gòu)一致；TLC法驗證其純度，均為單一斑點(diǎn)；通過HPLC面積歸一化法檢測，其純度大于98%．

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:XtimateTMC18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)．流動相：V(0.1%磷酸水溶液)∶V(乙腈)=75∶25，流速0.8 mL/min，檢測波長318 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，供試品溶液中傘形花內(nèi)酯與相鄰成分達(dá)到基線分離，分離度達(dá)到1.5以上，理論塔板數(shù)不低于3 000．色譜圖見圖1．

圖1 HPLC色譜圖(A 傘形花內(nèi)酯對照品，B 白鶴靈芝樣品，1傘形花內(nèi)酯)Fig.1 HPLC chromatographs(A:Umbelliferone standard substance; B:Rhinacanthus nasutus sapmle; 1:Umbelliferone)

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取傘形花內(nèi)酯對照品5.0 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.200 g/L的溶液，作為對照品溶液．

1.2.3 供試品溶液的制備 取白鶴靈芝樣品粉末約5 g，精密稱量，置250 mL圓底燒瓶中，準(zhǔn)確加入甲醇50.0 mL，稱取重量，回流提取30 min，放冷，再稱取重量，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻．精確吸取續(xù)濾液25.0 mL，置蒸發(fā)皿中，于水浴鍋上蒸干溶劑，殘渣用甲醇溶解并移至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，待用．取上述樣品供試液過0.45 μm的微孔濾膜即得．

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備 精密吸取上述傘形花內(nèi)酯對照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別吸取10 μL注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行分析測定其峰面積．以對照品溶液的濃度(X)為橫坐標(biāo),色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，求出回歸方程為:Y=56 510X+5.562 6，r=0.999 8．表明傘形花內(nèi)酯對照品在濃度為0.008～0.040 g/L范圍內(nèi)，樣品峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系．

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度考察 精密吸取對照品溶液10 μL，按1.2.1中色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積，測得傘形花內(nèi)酯RSD值為0.12%．表明儀器精密度良好．

2.1.2 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，室溫下分別在0，2，4，8，12，24 h內(nèi)按1.2.1中的色譜條件進(jìn)樣分析，測定其峰面積，在24 h內(nèi)傘形花內(nèi)酯峰面積的RSD值為0.76%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定．

2.1.3 重復(fù)性考察 取同批次樣品精密稱取5 g共6份，按1.2.3中方法配制供試品溶液，精密吸取10 μL，按1.2.1中的色譜條件測定，計算傘形花內(nèi)酯的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.108 5 mg/g，RSD值為2.81%(n=6)，表明樣品的重復(fù)性良好．

2.1.4 加標(biāo)回收率考察 采用加樣回收方法，精密稱取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品適量，準(zhǔn)確加入一定量對照品，按1.2.1方法測定，計算加樣回收率．見表3．

表3 加樣回收考察結(jié)果

2.1.5 樣品測定與結(jié)果 分別取不同編號的白鶴靈芝干燥粉末約5 g，精密稱定，按1.2.3中供試品制備方法制備，并按1.2.1中的色譜條件進(jìn)行分析測定，測定峰面積，計算傘形花內(nèi)酯的峰面積，結(jié)果見表4．

表4 白鶴靈芝傘形花內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果

3 討論

為獲得傘形花內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定的最佳分離圖譜，本實驗參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-14]分別考察了不同流動相對傘形花內(nèi)酯分離度的影響，最后選定V(0.1%磷酸水溶液)∶V(乙腈)=75∶25等度洗脫條件下獲得較好分離效果．

通過本實驗研究，白鶴靈芝藥材中傘形花內(nèi)酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在種植半年以后變化不大．白鶴靈芝種植半年之后約有0.5 m高，葉子鮮嫩也比較茂盛，可采收葉子做藥或制成茶包，其傘形花內(nèi)酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)已達(dá)到較好的水平．但由于多方面原因，本實驗只采集了生長了3個月、6個月和15個月的白鶴靈芝藥材，白鶴靈芝生長期對其傘形花內(nèi)酯含量是否達(dá)到平衡，有待進(jìn)一步的研究．

通過對比廣西和廣東部分地區(qū)的白鶴靈芝藥材的傘形花內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果，廣西產(chǎn)的白鶴靈芝質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，實驗表明廣西的地理環(huán)境、氣候很適合白鶴靈芝的種植，因此將種植白鶴靈芝藥材作為當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)，對提高地域經(jīng)濟(jì)效益有著重要的意義．

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