改良型磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解模型的構(gòu)建

劉 銘 張 健 魏小蘭 陳婷梅 劉慶蕓

(安康職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院，陜西 安康 725000)

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)已經(jīng)有100多年的歷史，是治療嚴(yán)重關(guān)節(jié)疾患、重塑關(guān)節(jié)功能的重要手段，是廣大關(guān)節(jié)患者的福音。然而，隨著關(guān)節(jié)置換例數(shù)的增多，假體晚期無(wú)菌松動(dòng)的問(wèn)題日趨嚴(yán)重，二次翻新治療給廣大患者無(wú)論是經(jīng)濟(jì)還是精神上帶來(lái)嚴(yán)重的創(chuàng)傷〔1〕。因此，任何有效的通過(guò)非手術(shù)方式來(lái)預(yù)防和治療人工關(guān)節(jié)無(wú)菌松動(dòng)這一晚期并發(fā)癥一直是關(guān)節(jié)外科的研究熱點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致無(wú)菌性關(guān)節(jié)松動(dòng)主要原因是磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解〔2〕。本次實(shí)驗(yàn)采用鹽結(jié)晶攜帶聚乙烯磨損顆粒置入部分去除小鼠顱骨外膜的顱頂處，建立骨溶解模型，探討其可行性，從而為人工關(guān)節(jié)松動(dòng)的研究提供簡(jiǎn)單、快捷、經(jīng)濟(jì)、方便、實(shí)用性強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料 實(shí)驗(yàn)選用近交系雌性BALB/c小鼠30只，8～10周齡，體質(zhì)量約20 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;聚乙烯微粒購(gòu)于美國(guó) Zimmer公司，微粒直徑為2～3 μm，用70%乙醇溶液反復(fù)沖洗顆粒，并浸泡24 h后用生理鹽水洗去酒精，制成生理鹽水的懸浮液，濃度為10 mg/ml;TRAP試劑盒購(gòu)于南京建成公司;電鏡日立-S-3000N，切片機(jī)德國(guó)LEICARM2135，OLYMPAS BX-50多功能顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 鹽結(jié)晶攜帶聚乙烯磨損顆粒磨的制備 5%生理鹽水2 ml和20 mg高分子聚乙烯顆粒充分混合，制成10 mg/ml濃度的鹽溶液。在常溫?zé)o菌環(huán)境下(超凈臺(tái))自然蒸發(fā)5～7 d，鹽溶液結(jié)晶。搗碎后制成鹽包埋磨損顆粒結(jié)晶體，在電子秤上分別稱出10包鹽(51 mg/包)包埋聚乙烯磨損顆粒和純鹽晶體待置。

1.2.2 體內(nèi)小鼠顱骨骨吸收模型的制作 30只清潔無(wú)菌小鼠，隨機(jī)分成三組，每組10只，生理鹽水組(A組)、純鹽組(B組)，C組，稱重并標(biāo)記。制備4%水合氯醛，按照1 ml/100 g體重進(jìn)行腹腔麻醉，麻醉成功后，小鼠頭部用脫毛劑給予充分脫毛，干凈后碘伏常規(guī)消毒，鋪一次性無(wú)菌巾，在小鼠顱頂矢狀線(垂直于小鼠雙側(cè)外耳道連線，并經(jīng)過(guò)此連線的中點(diǎn))用15號(hào)小圓刀或者小剪刀切開(kāi)1 cm左右皮膚及皮下組織。在助手成功對(duì)小鼠頭部皮膚牽引下，充分暴露小鼠顱頂1 cm2左右范圍完整骨膜。在顱頂處，用小圓刀輕輕剝離或者15號(hào)小鑷子輕輕撕脫小鼠顱骨外膜，形成0.2～0.2 cm骨膜缺損區(qū)(一般無(wú)出血，有少量出血時(shí)，用無(wú)菌紗布輕拭即可)。其中A組用消毒微量取樣槍吸取50 μl 5%生理鹽水滴入骨膜缺損區(qū)即可;B組放入無(wú)菌鹽顆粒51 mg即可，C組放入51 mg鹽包埋磨損顆粒結(jié)晶體，對(duì)于C組和B組在放置鹽結(jié)晶物或者純鹽顆粒時(shí)，應(yīng)盡量均勻放置在骨膜缺損區(qū)。然后用無(wú)菌、無(wú)損傷線縫合傷口。在整個(gè)手術(shù)過(guò)程中，小鼠眼睛用無(wú)菌紅霉素眼膏保護(hù)。模型構(gòu)建成功后，待小鼠麻醉清醒后分籠飼養(yǎng)。術(shù)后常規(guī)給予青霉素抗炎2 d，預(yù)防感染。術(shù)后14 d分別處死各組小鼠，無(wú)菌環(huán)境下取顱骨頂處骨組織(此項(xiàng)操作中要求取出的顱頂骨以正中矢狀線為中心的環(huán)形區(qū)域)，取出標(biāo)本用 PBS液沖洗，10%中性甲醛固定24 h，10%中性EDTA脫鈣液脫鈣14 d后蒸餾水沖洗70%酒精固定、石蠟包埋，切片機(jī)切片，連續(xù)三層切片，層厚6 μm(備用HE、TRAP染色)。對(duì)于送電鏡處取材小鼠，標(biāo)本用生理鹽水沖洗3遍，4%戊二醛固定送入電鏡室專業(yè)處理。

1.2.3 骨溶解的觀察及計(jì)算 選定切片，行常規(guī)HE染色，在10×、20×及40×條件下觀察顱頂骨膜炎性反應(yīng)和顱骨的表面侵蝕情況，以及骨組織細(xì)胞數(shù)量分布，每組選用3個(gè)標(biāo)本進(jìn)行觀察，每個(gè)標(biāo)本采集5個(gè)不同的視野，采用Image ProPlus 6.0(IPP)圖像分析軟件測(cè)量正中矢狀線區(qū)域骨吸收溶解面積，并對(duì)骨外膜炎性反應(yīng)細(xì)胞及骨組織內(nèi)細(xì)胞計(jì)數(shù)。TRAP染色是破骨細(xì)胞的特異性染色。將切片按照TRAP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，著色后破骨樣細(xì)胞呈棕紅色。Olympus電子顯微鏡20×、40×及100×條件下觀察，100×條件下攝像計(jì)算正中矢狀線區(qū)域的TRAP+細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4 骨片掃描電鏡檢查 小鼠深麻醉后，快速取出新鮮小鼠顱骨標(biāo)本用生理鹽水沖洗3遍，4%戊二醛固定2 h以上，再用OsO4固定1 h，生理鹽水沖洗3遍，單寧酸固定2 h以上，生理鹽水沖洗3遍，依次10%、30%、50%、70%、90%、100%酒精分別脫水15 min，再在30%、50%、70%、90%、100%叔丁醇中分別浸泡15 min以保護(hù)骨組織，4℃冰箱放置24 h后，放入液氮冷凍，干燥后真空噴吐金粉，在日立-S-3000N掃描電鏡下檢查小鼠顱骨表面的骨質(zhì)吸收情況采用IPP圖像分析軟件對(duì)各組吸收陷窩面積進(jìn)行計(jì)算分析，統(tǒng)計(jì)各組3個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本在500～3 000倍視野下取5個(gè)不同視野進(jìn)行陷窩面積計(jì)算，取平均值，計(jì)算其占視野面積的百分?jǐn)?shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)均以s表示。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 A組和B組骨表面溶解面積和骨內(nèi)細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果無(wú)明顯差別，但B組骨膜炎性反應(yīng)細(xì)胞略增高，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);加入鹽包埋磨損顆粒結(jié)晶體混合物無(wú)論骨溶解面積還是骨膜反應(yīng)以及骨組織內(nèi)骨細(xì)胞明顯增多(見(jiàn)圖1);小鼠顱頂骨膜反應(yīng)細(xì)胞滲出數(shù)結(jié)果 (個(gè)/視野):A組(1 540±368)、B組(1 610 ± 535)、C組(3 478±376)。骨組織內(nèi)骨細(xì)胞數(shù)量(個(gè)/視野)A組(10±3)、B組(12±2)、C組(25±5)(這點(diǎn)與TRAP染色結(jié)果較為一致)。A組和B組骨表面溶解面積和骨內(nèi)細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果無(wú)明顯差別，但B組骨膜炎性反應(yīng)細(xì)胞略增高，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);加入鹽包埋磨損顆粒結(jié)晶體混合物后骨溶解面積、骨膜炎性反應(yīng)細(xì)胞以及骨組織內(nèi)骨細(xì)胞明顯增多(P＜0.01)。

2.2 TRAP染色結(jié)果 A組和B組未見(jiàn)明顯染色區(qū)域，僅有少許紅色區(qū)域，細(xì)胞數(shù)量少;C組顆粒組染色深，陽(yáng)性染色面積區(qū)域大，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，并可見(jiàn)較明顯骨吸收的情況。TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果(個(gè)/視野):A組為(3.842 7±1.182 1)、B組為(4.026 1±1.37 2)、C組(17.325± 4.210 7)。A組與B組相比無(wú)明顯差別(P＞0.05);C組與A和B組比較:破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加，溶骨效應(yīng)增強(qiáng)，差異顯著(P＜0.01)。見(jiàn)圖1。

2.3 小鼠顱骨電鏡掃描檢查 見(jiàn)圖2。A組和B組:骨纖維組織結(jié)構(gòu)緊密，鈣丟失較少，未見(jiàn)明顯吸收陷窩;C組:陷窩形態(tài)多樣以圓形、橢圓形多見(jiàn)，同時(shí)可見(jiàn)臘腸型復(fù)合不規(guī)則性，骨吸收區(qū)凹陷形成巖溶現(xiàn)象;陷窩深淺不一，有些深的陷窩邊界清晰、底面粗糙、在陷窩中央可見(jiàn)片絮狀東西黏附，周圍及底部可見(jiàn)纖維紋路;有些陷窩較淺，僅有斑點(diǎn)狀骨質(zhì)吸收區(qū)域，骨片表面粗糙、鈣丟失明顯，骨質(zhì)疏松嚴(yán)重。IPP圖像軟件分析骨吸收區(qū)域與視野面積的百分比結(jié)果:A組(3.09±0.62)%、B組(3.25±0.78)%、C組(14.58±2.68)%，C組與A組、B組比較差異顯著(P＜0.05)。

圖1 各組小鼠顱骨組織病理圖片(×200)

圖2 各組小鼠顱骨組織電鏡觀察結(jié)果(SM，×200)

3 討論

面對(duì)日益增多關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)置換、返修患者，我們亟待解決假體關(guān)節(jié)無(wú)菌關(guān)節(jié)松動(dòng)這一難題。為此，我們需要建立一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、真實(shí)、可操作性強(qiáng)的模擬的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥鳛榛A(chǔ)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

目前國(guó)內(nèi)外在建立體外假體無(wú)菌松動(dòng)急性骨溶解病理模型中，多采用小鼠背部皮下氣囊植骨模型〔3，4〕，該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｔ炷：?jiǎn)單、節(jié)約時(shí)間、易操作;模擬性強(qiáng);實(shí)用性及敏感性好;其較強(qiáng)的氣囊壁炎性反應(yīng)，能夠方便檢測(cè)磨損顆粒誘導(dǎo)各類炎性因子，進(jìn)行細(xì)胞因子分析。但是，該實(shí)驗(yàn)最大缺點(diǎn)是沒(méi)有骨組織的參與〔5〕，缺少血供、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)支持不能真實(shí)模擬磨損顆粒在體內(nèi)誘導(dǎo)溶骨的真實(shí)環(huán)境，亦不能真實(shí)反映骨組織在重建中成骨細(xì)胞的修復(fù)和破骨細(xì)胞的溶骨的動(dòng)態(tài)平衡〔6〕。同樣，對(duì)于溶骨現(xiàn)象，這種動(dòng)物模型也無(wú)法考慮骨自身的修復(fù)作用，因此不能準(zhǔn)確做出溶骨定量測(cè)定。

在磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解模型中，國(guó)內(nèi)外多采用兩種方法:(1)皮膚縫合包埋法:這種方法在小鼠顱骨外膜外放置大量磨損顆粒后，皮膚縫合后完成。這種方法可行性強(qiáng)，也符合磨損顆粒誘導(dǎo)破骨細(xì)胞溶解骨組織致假體松動(dòng)體內(nèi)環(huán)境模擬。但這種實(shí)驗(yàn)?zāi)M需要大量磨損顆?！?〕，由于磨損顆粒價(jià)格高昂，需要大量實(shí)驗(yàn)資金投入。同時(shí)，大量磨損顆粒在顱骨外膜蓄積，骨外膜及皮膚、皮下組織炎性反應(yīng)強(qiáng)處，溶骨時(shí)間較短，不利于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行及觀察。此外，由于小鼠顱骨皮膚及皮下組織與顱骨外膜組織疏松，在小鼠清醒活動(dòng)時(shí)，大量磨損顆粒必然會(huì)沿著疏松的組織間隙向顱骨外膜周圍蔓延，甚至進(jìn)入小鼠眼眶、上唇、頸部周圍，造成多處周圍組織損傷和粘連，取材組織易遭破壞，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(2)磨損顆粒懸浮液顱骨外膜膜下注射法〔8，9〕:該法用微量注射器在顱骨表面注入顆粒懸液并均勻分布于骨表面。該法優(yōu)點(diǎn)是需要磨損顆粒少，操作方便。但是由于高分子聚乙烯磨損顆粒密度低，很難配制均勻磨損顆粒混合液，取等量標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)磨損顆粒量不均等，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察;另外，小鼠骨外膜組織特薄、疏松，注射液體時(shí)很易撐破骨外膜，并從進(jìn)針口和撐破處溢出，實(shí)際留置在骨表面的顆粒懸浮液較少，因此不能產(chǎn)生很好溶骨效應(yīng);其次，小鼠顱骨板很薄，進(jìn)針容易誤入顱內(nèi)，造成小鼠腦組織損傷甚至死亡。

“鹽溶法”在進(jìn)行本次小鼠顱骨溶解模型中建立中，首先在磨損顆粒(直徑為2～3 μm)〔10〕符合誘導(dǎo)溶骨條件的基礎(chǔ)上，利用鹽水和磨損顆?；旌虾?，自然條件下蒸發(fā)，得到鹽、磨損顆粒結(jié)晶體混合物，并把這種鹽混合結(jié)晶體放置在去部分顱骨外膜的顱頂處。由于鹽晶體的理化特性決定其溶解時(shí)和顱骨黏附較為緊密，在鹽溶解過(guò)程中逐漸把適量的磨損顆粒釋放出來(lái)，較為均勻地分布在顱骨外，達(dá)到直接放置磨損顆粒的目的;另外，在鹽晶體溶解過(guò)程中，周圍顱骨外膜會(huì)迅速長(zhǎng)入，很快把磨損顆粒完全包埋在骨膜下，不會(huì)出現(xiàn)磨損顆粒向周圍蔓延現(xiàn)象。次外，由于鹽溶解周圍的高滲狀態(tài)，不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)，便于傷口修復(fù)。該實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)是需要磨損顆粒少、花費(fèi)少、不易浪費(fèi)、易操作，并且把顆粒直接和骨面接觸，更符合假體松動(dòng)體內(nèi)骨溶解環(huán)境。但是和上述構(gòu)建模型一樣，此種模型沒(méi)有假體的植入，仍然屬于急性溶骨病理模型范疇。因此在研究松動(dòng)的過(guò)程中并沒(méi)有考慮機(jī)械應(yīng)力對(duì)松動(dòng)的影響，這與人工關(guān)節(jié)松動(dòng)發(fā)生的慢性溶骨過(guò)程是有差別的〔11〕。另外，在放入鹽磨損顆?；旌衔飼r(shí)對(duì)小鼠傷口有部分痛刺激作用，因此要求對(duì)小鼠麻醉程度要求較高?？傊緦?shí)驗(yàn)在磨損顆粒符合誘導(dǎo)溶骨條件的基礎(chǔ)上，通過(guò)HE、電鏡掃描、TRAP染色來(lái)觀察、分析骨膜炎性細(xì)胞滲出、骨破壞面積及破骨細(xì)胞數(shù)目變化表明小鼠顱骨發(fā)生了明顯的骨溶解、吸收現(xiàn)象，與人體內(nèi)磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解吸收表現(xiàn)非常相似。從總體而言，該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì)克服了上述各模型的不足，更加簡(jiǎn)潔方便、易操作，過(guò)程嚴(yán)謹(jǐn)可靠，結(jié)果合理有效，可信度高，值得推廣的一種基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方法。

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