視黃醇結(jié)合蛋白4在動脈粥樣硬化中的作用機(jī)制

付 鑫 張彥紅 張繼紅 萬 多 鄒慕蔚 吳桂平 (沈陽醫(yī)學(xué)院沈洲醫(yī)院，遼寧 沈陽 110002)

視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)的基因表達(dá)是炎癥反應(yīng)的標(biāo)志〔1，2〕，冠心病(CHD)患者的血漿 RBP4水平顯著升高，特別是急性冠脈綜合征患者升高更為明顯，RBP4是獨(dú)立于已知的CHD危險因素的又一新的危險因素〔3〕。有研究發(fā)現(xiàn)RBP4與FMD(通過血管外超聲測定的血流介導(dǎo)的血管擴(kuò)張值)顯著負(fù)相關(guān)，與血清可溶性黏附分子(sICAM)-1和sE-選擇素正相關(guān)，內(nèi)皮細(xì)胞可溶性黏附分子的表達(dá)可造成血管功能異常，提示RBP4可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的胰島素活性，導(dǎo)致血管舒張依賴的一氧化氮(NO)水平減弱，促進(jìn)血管內(nèi)皮功能紊亂〔4〕。推測RBP4可能在動脈粥樣硬化(AS)炎癥反應(yīng)過程中扮演著重要的角色，但其在人體內(nèi)確切的病理生理功能尚未完全闡明。本文探討CHD中血清RBP4與炎癥因子水平的相關(guān)性及RBP4促炎癥反應(yīng)的機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 對象及分組 所有病例組研究對象來自2011年3月至2012年1月沈陽醫(yī)學(xué)院沈洲醫(yī)院心內(nèi)科進(jìn)行冠脈造影術(shù)的患者，其中診斷為CHD的患者50例，診斷為AS的患者50例。對照組由來自本院體檢中心的50名健康的自愿者組成。所有研究對象簽訂知情同意書，同時經(jīng)過沈洲醫(yī)院倫理委員會同意。入選標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡55～70歲;(2)肝、腎、甲狀腺功能等臨床生化指標(biāo)正常;(3)近期無手術(shù)及外傷史;(4)未進(jìn)行降血脂治療;(5)取樣者之間無血緣關(guān)系。最后的統(tǒng)計(jì)分析中，包含了50名來體檢的普通人群〔平均年齡(51±3)歲，女性所占比例為42%〕，和50名經(jīng)冠脈造影確診為AS的患者〔平均年齡(58±4)歲，女性所占比例為34%〕。收集患者空腹12 h后的肝素抗凝全血，4℃ 4 000 r/min離心10 min，分離血漿及血細(xì)胞，用EP管分裝后貯存于－80℃。采用ELISA方法檢測血清RBP4、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的表達(dá)情況。

1.2 RBP4在AS小鼠模型中的表達(dá)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及動脈AS模型的建立 SPF級C57BL/6J 8周齡雄性載脂蛋白E(ApoE)基因敲除(Apo E－/－)小鼠10只為模型組，另以10只8周齡雄性C57BL/6J作為空白對照組。模型組小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，空白對照組小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)。連續(xù)喂養(yǎng)6 w。

1.2.2 標(biāo)本采集和組織學(xué)觀察 于實(shí)驗(yàn)第6周后取血處死動物。禁食 12 h后摘取眼球取血 1.5 ml，立即離心(4℃，800 r/min，15 min)，－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。處死動物時，用生理鹽水逆行灌注各組小鼠主動脈，自主動脈根部至腹主動脈離斷整個血管，切取臨近主動脈根部的動脈0.5 cm，縱行剖開展平后，用10%中性緩沖甲醛液固定、常規(guī)脫水后用油紅O染色觀察粥樣硬化斑塊，顯微鏡下拍照。

1.2.3 觀察指標(biāo) 采用全自動生化分析儀(美國雅培公司AEROSET)。酶法檢測血漿甘油三酯(TG)，總膽固醇(TC)，游離膽固醇(FC)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量。采用ELISA方法檢測血清RBP4、hs-CRP、MCP-1、IL-6的表達(dá)情況。采用RT-PCR法檢測斑塊組織中RBP4 mRNA的表達(dá)水平，采用Western印跡法檢測斑塊組織中RBP4蛋白及p38、c-jnk氨基末端激酶(JNK)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)值變量以s表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組間進(jìn)一步的比較采用SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 AS組、CHD組與對照組比較，TG、HDL-C、RBP4、IL-6 存在顯著差異，而 TC、FC、hs-CRP、MCP-1僅在CHD組與對照組間存在顯著差異。見表1。

表1 各組的臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較( s，n=50)

表1 各組的臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較( s，n=50)

與CHD組比較:1)P＜0.01;與AS組比較:2)P＜0.05

項(xiàng)目 對照組 AS組 CHD組51±3 56±4 58±4男/女(n)29/21 30/20 33/17 TC(mmol/L)4.08±0.5 4.09±0.69 4.78±0.561)TG(mmol/L)1.16±0.36 1.76±1.042) 1.81±0.641)FC(mmol/L)2.12±0.2 2.2±0.23 3.0±0.31)HDL-C(mmol/L)1.32±0.23 0.93±0.211) 0.84±0.111)RBP4(μg/ml)23.0±1.5 32.6±1.2 41.7±1.3 hs-CRP(mg/L)1.66±0.99 1.81±1.07 3.93±2.44 MCP-1(ng/L)0.18 ± 0.04 0.21±0.05 0.5±0.05 IL-6(ng/L)年齡(歲)2.1±0.14 3.0±0.22 6.0±0.31

2.2 RBP4與各種危險因素相關(guān)性分析 年齡、性別、TC、TG、FC 對RBP4 活性無顯著相關(guān)(r分別為0.1、0.02、0.054、0.053、0.074，均 P＞0.05);而 RBP4與 hs-CRP(r=0.38，P ＜0.001)、IL-6(r=0.45，P ＜0.001)、HDL-C(r=0.56，P ＜0.01)，MCP-1(r=0.47，P ＜0.01)呈正相關(guān)。

2.3 小鼠指標(biāo)檢測

2.3.1 各組血脂水平比較 模型組高脂6 w后，血脂水平明顯升高(P＜0.05)。見表2。

表2 對照組與模型組高脂前后血脂比較( s，mg/dl，n=10)

表2 對照組與模型組高脂前后血脂比較( s，mg/dl，n=10)

與對照組比較:1)P＜0.05;與模型高脂前比較:2)P＜0.05

TC 250.4±42.0 556.7±30.11)1 343.7±120.41)2)TG 91.4±9.7 85.0±10.0 143.9±31.11)2)FC 112.3±21.7 224.8±20.51) 407.8±33.51)2)HDL-C 11.9±3.2 12.1±3.0 12.4±2.7

2.3.2 胸腹主動脈AS斑塊面積分析 兩組主動脈血管壁均有斑塊形成，尤以主動脈弓處脂質(zhì)沉積較多，各組斑塊面積大小不等。胸腹部主動脈AS斑塊面積，兩組小鼠之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。見圖1，表3，表4。

圖1 模型組高脂前與高脂后斑塊比較(×100)

表3 模型組小鼠主動脈竇AS斑塊定量分析( s，n=10)

表3 模型組小鼠主動脈竇AS斑塊定量分析( s，n=10)

與高脂前比較:1)P＜0.05;下表同

組別 斑塊面積(μm2)斑塊面積/管腔面積(%)75 231±8 675 10.83±2.11高脂后 93 461±6 3451) 15.33±1.431)高脂前

表4 模型組小鼠胸腹主動脈AS斑塊定量分析( s，n=10)

表4 模型組小鼠胸腹主動脈AS斑塊定量分析( s，n=10)

組別 斑塊面積(μm2)斑塊面積/管腔面積(%)23 659±479 14.83±1.21高脂后 37 575±5221) 21.27±2.201)高脂前

2.3.3 模型組小鼠高脂前和高脂后RBP4蛋白水平的比較與對照組(0.86±0.14)相比，AopE－/－小鼠肝臟 RBP4、蛋白水平顯著增加(高脂前組1.31±0.37，高脂6 w后組1.83±0.29)(P＜0.01)。見圖2。

2.3.4 各組P38、JNK、ERK蛋白水平比較 見圖3。與對照組相比，模型組小鼠P38、JNK蛋白水平顯著增加(P＜0.01)，P38蛋白水平在高脂前組(0.93±0.08)、高脂6 w后組(1.51±0.63)、對照組(0.71±0.33);JNK蛋白水平在高脂前組(1.37±0.42)，高脂6 w 后組(1.49±0.65)、對照組(0.70±0.29)。ERK蛋白水平高脂前組(0.73±0.32)、高脂6 w后組(0.68±0.41)、對照組(0.69±0.31)，但ERK在三組之間沒有顯著性差異(P＞0.05)。

3 討論

炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，并且貫穿于AS斑塊形成、生長到破裂的全過程〔5～7〕。因此，干預(yù)炎癥反應(yīng)與干預(yù)脂質(zhì)代謝成為防治AS的兩大主要治療手段〔8〕。

脂肪細(xì)胞因子的分泌失衡或功能障礙在胰島素抵抗(IR)及心血管疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用，被視為IR和心血管疾病可能的中間環(huán)節(jié)〔5〕。脂肪組織不僅具有儲存能量的功能，還是機(jī)體最大的內(nèi)分泌器官，能產(chǎn)生和分泌多種生物活性物質(zhì)，統(tǒng)稱為脂肪細(xì)胞因子，包括脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素等，這些激素通過內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌的途徑發(fā)揮作用，參與IR和慢性炎癥的病理生理過程〔9〕。

RBP4是由脂肪細(xì)胞和肝分泌的一種蛋白質(zhì)分子，可能促進(jìn)全身IR，其編碼的基因位于10q23～q24，mRNA全長941 bp，其編碼的蛋白質(zhì)由201個氨基酸組成，主要由肝臟分泌，參與肥胖與IR發(fā)生機(jī)制。在肥胖、糖耐量受損、或2型糖尿病病人以及在有2型糖尿病家族史的非肥胖及非糖尿病的人群中，血清RBP4水平增高，血清RBP4水平與伴隨IR的心血管病危險因素密切相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織也參與了炎癥反應(yīng)。CHD患者血清RBP4顯著升高，且常伴隨炎癥因子表達(dá)增多，研究結(jié)果示血清RBP4與血清脂聯(lián)素、血白細(xì)胞和hs-CRP水平相關(guān)〔10〕;RBP4 mRNA 與 MCP-1 和 CD68 呈正相關(guān)〔11〕，在IR的幾個小鼠模型中，血液中RBP4水平明顯升高，在患肥胖癥和糖尿病人類研究中，同樣發(fā)現(xiàn)其含量的增加。如前所述，在嚙齒類動物血液中RBP4與IR高度相關(guān)，但在人類的研究中，情況卻不盡相同〔4，12〕。目前尚不清楚為什么在人群中存在這種差異。本研究中，RBP4在AS患者和CHD患者中的水平顯著增加，特別是CHD患者體內(nèi);同時在CHD患者中，hs-CRP和MCP-1也顯著增加，說明在AS逐漸轉(zhuǎn)化為CHD的過程中，炎癥反應(yīng)越來越明顯。同時，小鼠體內(nèi)的數(shù)據(jù)也證明無論是在器官內(nèi)，還是在外周血液中，RBP4含量都隨著AS的逐漸進(jìn)展而越來越多。

炎癥反應(yīng)是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程，MAPKs是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號到細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞反應(yīng)的四大信號系統(tǒng)之一，參與細(xì)胞生長、發(fā)育及細(xì)胞間功能同步等多種生理功能。目前已經(jīng)鑒定的MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路家族包括 P38、ERK、JNK、ERK3、ERK5/BMK1、ERK-7、NLK和ERK8等八個亞家族，這些亞族組成多條通路，其中p38和JNK主要對炎性細(xì)胞因子和多種類型的細(xì)胞應(yīng)激信號進(jìn)行傳導(dǎo)，而ERK主要對細(xì)胞生長、分裂和分化信號進(jìn)行傳導(dǎo)〔13〕。已有的研究表明p38、ERK和JNK三種通路均參與了 AS的病理過程〔14〕。本課題發(fā)現(xiàn) p38及 JRK在ApoE－/－小鼠體內(nèi)表達(dá)明顯增多，而ERK在三組中無明顯差異性，主要可能因?yàn)镻38及JNK參與炎性細(xì)胞因子和多種類型的細(xì)胞應(yīng)激信號傳導(dǎo)，而ERK參與了細(xì)胞的生長、分裂和分化信號傳導(dǎo)。

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