慢性鋁過負(fù)荷對大鼠的肝損傷作用

雷文娟 何 琴 余麗娟 郭遠(yuǎn)新 王健峰 潘永全 羅 映 余華榮 楊俊卿

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，重慶 400016)

鋁廣泛存在環(huán)境的土壤、水和空氣中，也是人們生活中運(yùn)用最廣的金屬〔1〕。金屬鋁存在于玉米、黃色的奶酪、鹽、草藥、茶葉、香料、瓷器和容器中，也用作藥品添加劑和飲用水純化劑〔2〕，因此，人們不可避免頻繁接觸鋁?？紤]到機(jī)體鋁的蓄積，歐洲食品安全局在2008年制定了每周食物鋁攝入的最大耐受標(biāo)準(zhǔn)，并認(rèn)為歐洲一些國家的普通人群食物鋁攝入已超過該標(biāo)準(zhǔn)〔3〕，然而直到1975年第1例鋁相關(guān)性腦病的報(bào)道，鋁的組織器官毒性才引起學(xué)者重視〔4〕?，F(xiàn)有研究表明，鋁可引起腎毒性、骨毒性、肺毒性、心毒性和神經(jīng)毒性〔5，6〕，肝是金屬離子容易蓄積的臟器，鋁在肝臟的累積可能比腦等組織更明顯〔1〕。鋁主要蓄積在肝的巨噬細(xì)胞和溶酶體等細(xì)胞器〔7〕，但是長期接觸鋁特別是某些職業(yè)工人的肝毒性并沒有引起足夠的重視〔8〕。本研究采用大鼠慢性口服給鋁的方式，觀察鋁負(fù)荷大鼠的肝功能和形態(tài)學(xué)改變，并初步探討其機(jī)制，為長期鋁接觸的肝毒性臨床研究提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與主要試劑 雄性清潔級Wistar大鼠24只，質(zhì)量220～250 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證書號：SCXK(渝)2007-0001。葡萄糖酸鈉(BR，成都市科龍化工試劑廠，批號：20100909)，氯化鋁六水(AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20110113)，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒、肝功測試試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖酸鋁溶液配制 稱取六水三氯化鋁17.9 mg、葡萄糖酸鈉9.9 mg，溶于雙蒸水，溶液清澈后用0.1 mol/L NaOH將溶液滴定到pH6.0左右，最后用雙蒸水定容為100 ml(Al3+濃度為2%)。

1.2.2 慢性鋁過負(fù)荷致肝損傷大鼠模型的建立 24只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)3 d，分為2組，每組12只大鼠，即空白對照組(等體積的0.3%羧甲基纖維素鈉灌胃給予)，慢性鋁過負(fù)荷(200 mg Al3+/kg)模型組。每周灌胃5 d，連續(xù)20 w，灌胃容積為1 ml/100 g。動(dòng)物有關(guān)的所有實(shí)驗(yàn)與操作均在重慶醫(yī)科大學(xué)道德與倫理委員會許可和指導(dǎo)下進(jìn)行。

1.2.3 組織病理學(xué)觀察 在停止給予鋁鹽后第1天，每組各取3只大鼠，用4%水合氯醛 i.p.麻醉后，仰臥固定，打開胸腔，剪碎脾臟作為血液和灌注液出口，由左心室快速滴入肝素化生理鹽水100 ml，然后滴入200 ml多聚甲醛(4%)，進(jìn)行在體肝組織固定。分離肝組織，石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察肝形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.2.4 SOD活性和MDA含量測定 停止給予鋁鹽后第2天，每組各取4只大鼠，斷頭處死，收集全血1 ml，肝素抗凝，分離血漿，以進(jìn)行肝功測定。分離肝組織，用冰冷生理鹽水做成10%勻漿。分別按照SOD和MDA試劑盒說明書要求的操作步驟測定其活性和含量。蛋白質(zhì)含量采用雙縮脲法，具體操作按雙縮脲蛋白測定試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。

1.2.5 肝功能測定 將上述血漿進(jìn)行肝功測定，指標(biāo)包括血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，堿性磷酸酶(ALP)，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)，分別按照相應(yīng)試劑盒說明書要求的操作步驟進(jìn)行測定。

1.2.6 肝組織鋁離子含量測定 停止給予鋁鹽后第2天，每組各取5只大鼠，斷頭處死，分離肝組織，加入25%四乙基氫氧化銨溶液，80℃消化24 h后加雙蒸水定容，鋁離子含量采用等離子體原子發(fā)射光譜分光光度儀(美國，PE)，用內(nèi)標(biāo)法測定，測定波長為309.3 nm。

2 結(jié)果

2.1 肝組織鋁離子含量 與空白對照組相比，慢性鋁負(fù)荷大鼠肝組織鋁離子含量明顯增加〔(1.98±0.19)vs(2.45±0.32)μg/g，P=0.027〕。

2.2 慢性鋁過負(fù)荷大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化 空白對照組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)清楚、完整，肝細(xì)胞排列及層次分明，而慢性鋁過負(fù)荷模型組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)雖然仍清楚，但是肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯空泡變性、顆粒變性和點(diǎn)狀壞死(圖1)。

2.3 慢性鋁過負(fù)荷大鼠血漿ALT、AST、ALP和GGT變化 如表1所示，與空白對照組相比，慢性鋁負(fù)荷大鼠血漿ALT和AST濃度有增高的趨勢，但是沒有顯著性。而模型組大鼠血漿ALP和GGT水平顯著升高，以ALP升高更為明顯(P＜0.01，P＜0.05)。

表1 鋁負(fù)荷大鼠血漿ALT、AST、ALP和GGT變化(s，n=4，IU/L)

與空白對照組比較：1)P＜0.05，2)P＜0.01

ALT AST ALP GGT空白對照組組別34±12.19 85±20.54 91.5±43.09 36±16.8模型組 56±21.88 104.6±32.31 180.4±32.432)65.8±20.31)

表2 慢性鋁過負(fù)荷大鼠肝組織SOD活性和MDA含量的影響( s ，n=4)

表2 慢性鋁過負(fù)荷大鼠肝組織SOD活性和MDA含量的影響( s ，n=4)

與空白對照組比較：1)P＜0.01

組別 SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)空白對照組11.73±1.56 0.49±0.08模型組 8.19±0.611) 1.37±0.421)

2.4 慢性鋁過負(fù)荷大鼠肝組織SOD活性和MDA含量變化與空白對照組相比，慢性鋁過負(fù)荷模型組大鼠肝組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，(P＜0.01)，見表2。

3 討論

鋁廣泛存在于人們生存的大氣、土壤和水環(huán)境，自1827年發(fā)現(xiàn)金屬鋁，20年后鋁產(chǎn)品開始出現(xiàn)，以后廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、交通和生活領(lǐng)域?，F(xiàn)有的研究表明鋁不像鐵、錳和鋅等微量元素為機(jī)體生理功能所必需，至今尚未發(fā)現(xiàn)鋁的生理功能。因此，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為鋁進(jìn)入機(jī)體僅造成機(jī)體組織器官的損傷。由于鋁主要蓄積在肝的巨噬細(xì)胞和溶酶體等細(xì)胞器，肝細(xì)胞可以將鋁與溶酶體一起從膽汁排泄，因此有學(xué)者認(rèn)為鋁不會導(dǎo)致明顯肝毒性〔5〕。

本研究結(jié)果顯示，葡萄糖酸鋁連續(xù)灌胃給予20 w，大鼠肝組織鋁明顯增高，同時(shí)肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯空泡變性、顆粒變性和點(diǎn)狀壞死，同時(shí)肝功能出現(xiàn)異常改變，ALT和AST濃度有增高的趨勢，而ALP和GGT水平顯著升高。與我們研究結(jié)果相似，Bogdanovic等〔8〕采用腹腔注射給鋁(50 mg/kg Al大鼠)，連續(xù)7 w，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鋁明顯蓄積，肝基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)完整，可見膽管輕度增生和脂肪變性。Viezeliene等〔9〕發(fā)現(xiàn)腹腔注射三氯化鋁導(dǎo)致ALT升高4倍，同時(shí)GSH明顯下降。大鼠腹腔注射27 mg/kg Al(OH)3，每周3次，連續(xù)3 w，明顯誘導(dǎo)了大鼠膽汁郁積和膽小管陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，GSH含量明顯降低，MDA含量明顯增加。Türkez等〔10〕采用 34 mg/kg AlCl3灌胃給予大鼠 30 d，血漿ALP、LDH、ALT和AST顯著升高，病理學(xué)檢查顯示肝血竇擴(kuò)張、中央靜脈充血、脂質(zhì)蓄積和淋巴細(xì)胞浸潤。這些結(jié)果提示，慢性鋁負(fù)荷能明顯導(dǎo)致肝功能異常和肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損害，應(yīng)該注意日常生活中鋁的攝入，特別是對于某些長期高濃度接觸鋁的職業(yè)工人。

關(guān)于鋁組織器官毒性的機(jī)制，至今尚不清楚。我們研究結(jié)果提示鋁肝毒性的機(jī)制可能與鋁促氧化特性有關(guān)，但是，是否還有其他機(jī)制參與，需要進(jìn)一步深入研究。

1 Kumar V，Gill KD.Aluminium neurotoxicity：neurobehavioural and oxidative aspects〔J〕.Arch Toxicol，2009;83(11)：965-78.

2 Ochmanski W，Barabasz W.Aluminium-occurrence and toxicity for organisms〔J〕.Przegl Lek，2000;57(6)：665-8.

3 EFSA.Scientific opinion of the panel on food additives，flavourings，processing aids and food contact materials on a request from European Commission on safety of aluminium from dietary intake〔J〕.EFSA J，2008;754(1)：1-4.

4 Sjogren B，Iregren A，Elinder CG，et al.Aluminum.In：Nordberg GF，F(xiàn)owler BA，Nordberg M，et al.ed.Handbook on the toxicology of metals〔M〕，3rd ed.Amsterdam-Tokyo：Academic Press，2008：339-65.

5 Reinke CM，Breitkreutz J，Leuenberger H.Aluminium in over-the-counter drugs：risks outweigh benefits〔J〕?Drug Saf，2003;26(14)：1011-25.

6 Sushma NJ，Rao KJ.Total ATPases activity in different tissues of albino mice exposed to aluminium acetate〔J〕.J Environ Biol，2007;28(2)：483-4.

7 Tetsuji N，Kiyokazu K.Aluminium accumulation in the human body and experimental animals〔J〕.J Health Environ Sci，2005;1(1)：12-48.

8 Bogdanovi M，Janeva AB，Bulat P.Histopathological changes in rat liver after a single high dose of aluminum〔J〕.Arch Hig Rada Toksikol，2008;59(2)：97-101.

9 Viezeliene D，Jansen E，Rodovicius H，et al.Protective effect of selenium on aluminium-induced oxidative stress in mouse liver in vivo〔J〕.Envir Toxicol Pharmacol，2011;31(2)：302-6.

10 Türkez H，Yousef MI，Geyikoglu F.Propolis prevents aluminium-induced genetic and hepatic damages in rat liver〔J〕.Food Chemi Toxicol，2010;48(10)：2741-6.