基于酪氨酸酶的絲素蛋白膜的制備及其性能

李新玥，邢鐵玲

(蘇州大學(xué)紡織與服裝工程學(xué)院，江蘇蘇州215021)

絲素蛋白具有良好的綠色環(huán)保性能，一直是人們研究的熱點(diǎn)。早期的絲素蛋白主要用于食品添加劑和化妝品中［1］。在目前的研究中，絲素蛋白由于與生俱來的無毒性、無刺激性，優(yōu)良的生物相容性和可降解性等優(yōu)勢，常被用于制備人工皮膚、人工骨骼、酶固定化材料、藥物緩釋載體、抗血凝性材料、細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)等生物醫(yī)用材料的重要可選原料［2］。

絲素蛋白溶液直接經(jīng)一般條件烘干、靜電紡或冷凍干燥等方法制得膜、無紡網(wǎng)和多孔支架等不同形態(tài)的材料，其聚集態(tài)結(jié)構(gòu)多以無規(guī)卷曲為主，分子間的結(jié)合力較弱，在水中溶失率大，限制了絲素蛋白材料的應(yīng)用［3］。當(dāng)前多采用各種物理和化學(xué)方法制備共混的絲素膜，從而得到耐水性好的材料。

酪氨酸酶(Tyrosinase)是一種含銅的金屬酶，廣泛分布于微生物、動植物及人體中，它具有雙重的生物催化作用，既有單酚酶活性又有二酚酶活性，既能催化單酚類化合物生成鄰苯二酚，又能氧化鄰苯二酚脫氫生成鄰苯醌，能將酪氨酸羥化，產(chǎn)生L-多巴，然后再將多巴氧化成多巴醌，進(jìn)而生成一系列引起褐化的色素類物質(zhì)［4］。

絲素蛋白中含有18種氨基酸，其中酪氨酸、絲氨酸、谷氨酸和酪氨酸等約占氨基酸總量的30%。將酪氨酸酶引入到絲素蛋白體系中，它能催化其中的酪氨酸發(fā)生酶促氧化反應(yīng)，使得蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生交聯(lián)［5-6］?；谶@樣的反應(yīng)原理，用酪氨酸酶作為交聯(lián)試劑，加入到絲素蛋白溶液中，在一定的條件下制成溶失率較低的交聯(lián)絲素膜。與現(xiàn)有的添加化學(xué)交聯(lián)劑成膜，如添加聚乙二醇縮水甘油醚形成不溶于水的絲素膜相比［7］，本研究具有生態(tài)、環(huán)保的優(yōu)勢。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料:桑蠶絲(江蘇蘇豪國際集團(tuán)股份有限公司)，酪氨酸酶(Sigma)，無水碳酸鈉，溴化鋰，透析袋。

實(shí)驗(yàn)儀器:MP516型溶解氧分析儀(上海三信儀表廠)，TU-1810紫外/可見分光光度計(jì)(北京普析有限責(zé)任公司)，美國Instron3365萬能材料試驗(yàn)機(jī)、YG(B)141D數(shù)字式織物厚度儀(溫州市大榮紡織儀器有限公司)。

1.2 絲素溶液的制備

家蠶生絲用無水碳酸鈉完全脫膠，經(jīng)充分烘干后用9.3 mol/L的溴化鋰溶液溶解(60℃ ×30 min)，經(jīng)透析、過濾之后得到絲素溶液，用稱重法計(jì)算絲素溶液的含固率。

1.3 絲素膜的制備

按照一定的比例將酪氨酸酶加入到絲素蛋白溶液中，在一定的工藝條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將溶液置于準(zhǔn)備好的盒子中風(fēng)干，制得絲素膜。

2 實(shí)驗(yàn)測試

2.1 酶促反應(yīng)的溶解氧分析

用MP516型溶解氧分析儀在一定的條件下測試酶促反應(yīng)體系溶解氧的變化情況。

2.2 絲素蛋白溶液吸光度測試

用紫外/可見光分光光度計(jì)在200～400 nm測定不同條件下絲素溶液的吸光度，并優(yōu)化出最佳的反應(yīng)工藝。

2.3 絲素膜的理化性能測試

2.3.1 含水率

將絲素膜在恒溫恒濕(25℃，相對濕度65%)下平衡24 h，每個稱取質(zhì)量w1(g)的樣品3塊，然后在烘箱中105℃烘至恒重，稱量得到w2(g)。則根據(jù)公式(1)計(jì)算出含水率。

2.3.2 溶失率

將絲素膜在同一室溫條件下平衡24 h，然后稱取w3(g)，放入編過號的錐形瓶中，按浴比1︰100加入去離子水，在37℃的水浴恒溫震蕩器中預(yù)熱30 min后震蕩24 h，然后取出溶液。溶液離心后取上層清液，用紫外分光光度計(jì)測出各溶液在275 nm下的吸光度并記錄。由測出的吸光度，根據(jù)公式計(jì)算出溶解的絲素重量，即可得出絲素膜的蛋白溶失率。

式中:C為絲素蛋白溶失率，%;K為絲素溶液的紫外吸光常數(shù)，mL/g;A為吸光度;V為溶液體積，mL;w3為樣重品質(zhì)量，g。

2.3.3 力學(xué)性能

將絲素膜剪成60 mm×10 mm的長條狀，編號后測定每個樣片的厚度。于恒溫恒濕(25℃，相對濕度65%)下平衡24 h后在Instron3365萬能材料試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行拉伸測試，夾距為20 mm，拉伸速度為20 mm/min。按公式計(jì)算膜的斷裂強(qiáng)度。

式中:P為膜的斷裂強(qiáng)度，MPa;F為膜的斷裂強(qiáng)力，N;d為膜的寬度，mm;h為膜的厚度，mm。

按公式計(jì)算膜的初始模量。

式中:E0為初始模量，MPa;Pa為拉伸負(fù)荷，N;l0為試樣的夾持長度，mm;Δla為試樣伸長值，mm;S為試樣橫截面積，mm2。

2.4 氨基酸分析

將待測絲素膜試樣置于水解管中，加入6.0 mol/L HCl溶液，與110℃下密封水解24 h，過濾，蒸干;再加入0.02 mol/L的HCl溶液，在真空中放置30 min，采用Hitachi 835-50氨基酸自動分析儀測定除色氨酸以外的其他氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.5 X射線衍射分析

使用全自動X'PERT-PRO MPD射線衍射儀，CuKα射線，X射線波長:λ=1.5406?計(jì)數(shù)器:超能探測計(jì)數(shù)器，記錄得到絲素膜2θ=5°～50°的衍射強(qiáng)度曲線。

3 結(jié)果與討論

3.1 酶促反應(yīng)的溶解氧分析

圖1為酪氨酸酶催化絲素蛋白上L-酪氨酸發(fā)生反應(yīng)的原理式，該反應(yīng)需要在氧氣存在的情況下才能正常進(jìn)行［8］，如果不及時給反應(yīng)浴補(bǔ)充氧氣，反應(yīng)浴中的氧氣會逐漸減少。改變交聯(lián)反應(yīng)的溫度，采用溶解氧分析儀對密閉的絲素溶液體系的溶解氧進(jìn)行測試。測試結(jié)果如圖2所示，其溶解氧變化曲線可分為3個階段。反應(yīng)前10 min，反應(yīng)浴內(nèi)的溶解氧含量充足，主要進(jìn)行有氧反應(yīng)，生成L-多巴和多巴醌。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到30 min左右時，體系內(nèi)溶解氧含量逐漸降低，有氧反應(yīng)和不需氧氣的邁克爾加成反應(yīng)同時進(jìn)行，并且達(dá)到一個相對平衡，所以在這一個階段氧氣消耗量趨于平緩。在最后一個反應(yīng)階段，隨著反應(yīng)進(jìn)行，體系內(nèi)溶解氧逐漸消耗而且沒有新的氧氣補(bǔ)充進(jìn)來，體系內(nèi)的氧氣逐漸消耗，直至被消耗完反應(yīng)結(jié)束［9］。

圖1 酪氨酸酶對絲素蛋白的催化反應(yīng)Fig.1 Catalytic reaction of silk fibroin by tyrosinase

圖2又可見，隨著反應(yīng)溫度升高，體系內(nèi)的溶解氧量消耗速度逐漸變快。當(dāng)反應(yīng)溫度為25℃時，反應(yīng)進(jìn)行70 min時體系內(nèi)的溶解氧量只發(fā)生較小變化;當(dāng)溫度升到45℃，反應(yīng)進(jìn)行到30 min時，體系內(nèi)的溶解氧就降為零。即在同樣的反應(yīng)配比下，反應(yīng)浴溫度越高，酪氨酸酶越快發(fā)揮催化作用，使得酶促反應(yīng)速率加快，反應(yīng)浴內(nèi)的氧氣消耗也相應(yīng)加快，使得溶解氧曲線產(chǎn)生了如圖2所示的差異。因此，可以證明絲素上的酪氨酸殘基確實(shí)被酪氨酸氧化。

圖2 反應(yīng)溫度對酶促反應(yīng)的溶解氧消耗的影響Fig.2 Effect of enzymatic reaction temperature on oxygen consumption

3.2 酶促反應(yīng)條件對絲素溶液吸光度的影響

3.2.1 酪氨酸酶用量對絲素-酪氨酸酶溶液吸光度的影響

固定反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間，改變酪氨酸酶的用量，用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm對反應(yīng)后的溶液的吸光度進(jìn)行測試。

絲素和酪氨酸酶在一定的溫度和時間下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，溶液由原來的無色透明變?yōu)榧t棕色，隨著酶用量的增多這種變色更加明顯。如圖3所示，與空白的酪氨酸酶溶液和絲素溶液組對照，添加酪氨酸酶的溶液在340～360 nm的吸收顯著增大，并且隨著酪氨酸酶用量增加，吸光度逐漸增大，在350 nm出現(xiàn)了一個較寬的吸收峰。并且蛋白質(zhì)在280 nm附近的吸收峰逐漸向300 nm移動。

如圖1反應(yīng)機(jī)理所示，酪氨酸酶催化絲素蛋白反應(yīng)會生成L-多巴和多巴醌。有研究指出，酪氨酸酶催化絲素蛋白反應(yīng)后生成的300 nm和360 nm吸收峰分別是L-多巴和多巴醌的吸收峰［9-11］。當(dāng)?shù)孜餄舛认嗤瑫r，反應(yīng)后溶液的紅棕色越深，在340～360 nm的吸光度越大，則生成的L-多巴和多巴醌越多，即認(rèn)為絲素蛋白的交聯(lián)程度越高，所以在本組實(shí)驗(yàn)中4 000 U/g的酶量交聯(lián)效果最好(即每克絲素蛋白需要4 000 U的酪氨酸酶，下同)。

對汾河流域節(jié)水灌溉發(fā)展水平的準(zhǔn)確評價，是正確認(rèn)識汾河流域節(jié)水灌溉發(fā)展水平、推動本區(qū)域節(jié)水灌溉發(fā)展的基礎(chǔ)，是制定區(qū)域節(jié)水政策、方案和措施的科學(xué)依據(jù)。近年來，節(jié)水灌溉發(fā)展水平綜合評價已經(jīng)由最初的定性描述分析或定量數(shù)據(jù)比較發(fā)展到定性與定量相結(jié)合[1]，由依靠主要指標(biāo)構(gòu)建簡單的評價體系發(fā)展到利用多指標(biāo)或多目標(biāo)構(gòu)建綜合評價體系。

圖3 酪氨酸酶用量對絲素-酪氨酸酶溶液吸光度的影響Fig.3 Effect of tyrosinase dosage on absorption of silk-tyrosinase solution

3.2.2 反應(yīng)溫度對絲素-酪氨酸酶溶液吸光度的影響

固定酪氨酸酶用量和反應(yīng)時間，改變反應(yīng)溫度，對反應(yīng)后溶液的吸光度進(jìn)行測試。從圖4可以看出，改變反應(yīng)溫度后，溶液的吸光度發(fā)生較大變化。從25℃開始升高反應(yīng)溫度，反應(yīng)后溶液的吸光度逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)溫度升高到60℃時，溶液的吸光度反而降低。

圖4 反應(yīng)溫度對絲素-酪氨酸酶溶液吸光度的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on absorption of silk-tyrosinase solution

反應(yīng)溫度通過影響酪氨酸酶的活性影響反應(yīng)后溶液的吸光度值。在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)溫度太低，酪氨酸酶活性釋放較慢，反應(yīng)需要很長時間;反應(yīng)溫度太高，酪氨酸酶存在失活的可能。當(dāng)反應(yīng)溫度為25℃時酪氨酸酶緩慢釋放活力，相同時間內(nèi)催化交聯(lián)的L-酪氨酸含量少，生成的L-多巴和多巴醌的量也相應(yīng)較少，使得吸光度值也低。隨著溫度升高，酪氨酸酶活力釋放速度增大，交聯(lián)反應(yīng)速率增大，生成較多的有色物質(zhì)，吸光度值增大。但當(dāng)溫度升高到60℃時，酪氨酸酶存在失活的可能，而且酪氨酸酶在較短的時間內(nèi)釋放較多的酶活，一部分酪氨酸酶還沒來得及發(fā)生催化交聯(lián)就已經(jīng)失去酶活，這對發(fā)揮酶的高效催化作用是不利的，導(dǎo)致最終反應(yīng)后溶液呈現(xiàn)偏黃的棕色，吸光度值反而降低。綜合以上分析，選擇45℃為酶促反應(yīng)的最佳溫度。

3.2.3 反應(yīng)時間對絲素-酪氨酸酶溶液吸光度的影響

固定酪氨酸酶用量和反應(yīng)溫度，改變反應(yīng)時間，對反應(yīng)后溶液的吸光度進(jìn)行測試。從圖5可以看出，隨著反應(yīng)時間延長，絲素溶液在350 nm附近的吸收峰逐漸抬高，并且峰形越來越明顯。反應(yīng)時間為0時，酶促反應(yīng)并未開始，溶液在350 nm左右的吸光度值接近于0。隨著反應(yīng)時間延長，酶促反應(yīng)生成的L-多巴和多巴醌的量逐漸積累，在350 nm附近的吸光度值逐漸增大。在反應(yīng)的前120 min內(nèi)，350 nm附近的吸光度值快速增大，繼續(xù)延長反應(yīng)時間，吸光度值有較小增大，但反應(yīng)進(jìn)行到120 min時繼續(xù)延長時間，反應(yīng)后溶液的顏色從紅棕色向黃棕色變化，可能生成了其他更加復(fù)雜的催化產(chǎn)物，所以選定反應(yīng)時間為120 min。

圖5 反應(yīng)時間對絲素-酪氨酸酶溶液吸光度的影響Fig.5 Effect of reaction time on absorption of silk-tyrosinase solution

3.2.4 空氣和氧氣對絲素-酪氨酸酶溶液吸光度的影響

從上述溶解氧分析中可知，在密閉條件下酪氨酸酶催化酪氨酸殘基發(fā)生反應(yīng)，體系內(nèi)的氧氣會逐漸消耗直至殆盡。通過給反應(yīng)浴中通氧氣和空氣的方法給反應(yīng)浴中補(bǔ)充氧氣，用不通任何氣體作為對照，對反應(yīng)后溶液吸光度進(jìn)行測試。如圖6所示，通氧氣的絲素溶液反應(yīng)后在350 nm的吸光度值明顯大于通空氣和對照組的。

圖6 空氣和氧氣對絲素-酪氨酸酶溶液吸光度的影響Fig.6 Effect of air and oxygen on absorption of silk-tyrosinase solution

3.3 絲素膜的溶失率和力學(xué)性能

在上述工藝條件下，改變酪氨酸酶的用量，用流延法制成絲素膜，并對所成絲素膜的溶失率膜的力學(xué)性能進(jìn)行測試。如圖7所示，純絲素膜的溶失率為24%，隨著酶用量增大，膜的溶失率逐漸降低，當(dāng)酶用量增大到2 000 U/g時，膜的溶失率降到了11.2%，當(dāng)酶用量繼續(xù)增大到1︰4 000 U/g時，溶失率只有3.2%。斷裂強(qiáng)度也有同樣的變化趨勢，在初始酶用量較少時，膜的斷裂強(qiáng)度只有較小程度的提高，當(dāng)酶用量增大到1︰2 000 U/g時，膜的斷裂強(qiáng)度達(dá)到了最大值，但是當(dāng)酶用量繼續(xù)增大到1︰4 000 U/g時，膜的斷裂強(qiáng)度反而降低。

圖7 酪氨酸酶用量對絲素膜的溶失率和斷裂強(qiáng)度的影響Fig.7 Effect of tyrosinase dosage on water solubility and rupture strength of SF membrane

當(dāng)?shù)孜餄舛认嗤瑫r，一定范圍內(nèi)，隨著酪氨酸酶用量的增多，酶促交聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行的更加充分，蛋白質(zhì)之間交聯(lián)程度更大，所以膜的溶失率和斷裂強(qiáng)度逐漸改善。

表1為用不同量的酪氨酸酶交聯(lián)絲素蛋白所成絲素膜的初始模量和斷裂伸長率分析。隨著酪氨酸酶用量增多，絲素膜的初始模量逐漸增大，當(dāng)酪氨酸酶用量為4 000 U/g時，膜的初始模量迅速降低，幾乎等同于未交聯(lián)膜的初始模量。隨著酪氨酸酶用量增多，膜的初始模量增大，可認(rèn)為隨著交聯(lián)程度的增大，膜的斷裂由原來的韌性斷裂向脆性斷裂轉(zhuǎn)變。但當(dāng)酶用量增大到一定程度之后對膜的交聯(lián)沒有更大的改善，使其初始模量降低。從斷裂伸長率的數(shù)據(jù)可以看出，酪氨酸酶用量發(fā)生改變，膜的斷裂延伸率幾乎不發(fā)生變化。

表1 酪氨酸酶用量對絲素膜的初始模量和斷裂伸長率的影響Tab.1 Effect of tyrosinase dosage on elongation and initial modulus of crosslinked SF membrane

綜上所述可認(rèn)為，酪氨酸酶對絲素蛋白的交聯(lián)作用，較大程度地改善了膜的溶失率和斷裂強(qiáng)度，但是膜的韌性有所降低。

3.4 絲素膜的氨基酸分析

交聯(lián)與未交聯(lián)絲素膜的氨基酸含量分析如表2中所示。交聯(lián)反應(yīng)對絲素膜中氨基酸的種類無影響，但對各種氨基酸的含量有較大影響。未交聯(lián)絲素膜中酪氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.41%，交聯(lián)絲素膜中酪氨酸含量逐漸減少，并且隨著酪氨酸酶用量增多，其中酪氨酸含量逐漸降低(當(dāng)酪氨酸酶用量為4 000 U/g時，膜中的酪氨酸含量僅為6.36%)。

已知酪氨酸酶可以特定的催化酪氨酸發(fā)生氧化反應(yīng)，在本研究中當(dāng)絲素蛋白底物濃度不變時，在一定的范圍內(nèi)隨著酪氨酸酶用量增多，酪氨酸發(fā)生催化氧化的機(jī)率增多，則有更多的酪氨酸參與氧化反應(yīng)，最終使得其中酪氨酸含量減少。這一結(jié)果與上述研究相吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了酪氨酸酶催化絲素蛋白中的酪氨酸，發(fā)生了氧化交聯(lián)反應(yīng)。

表2 絲素膜的氨基酸含量分析Tab.2 Amino acid composition of silk membrane %

3.5 絲素膜的X射線衍射分析

如圖8所示，兩種絲素膜在12.2°(Silk I)和9.1°(Silk II)均無明顯吸收峰，說明純絲素膜和酪氨酸酶催化交聯(lián)絲素膜均以無歸卷曲結(jié)構(gòu)為主。只是絲素膜在20°的峰形稍為尖銳，這說明交聯(lián)前后絲素膜的結(jié)晶結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯變化。從膜的熱水溶解性分析可知，交聯(lián)后膜的熱水溶失率明顯降低，這說明在絲素蛋白結(jié)構(gòu)聚集態(tài)結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化的情況下，絲素蛋白分子之間形成了交聯(lián)，這種交聯(lián)使絲素分子結(jié)構(gòu)從線性向體型轉(zhuǎn)變，從而使其不溶于水。X射線衍射結(jié)果進(jìn)一步說明酪氨酸酶催化了絲素蛋白大分子的交聯(lián)反應(yīng)。

圖8 絲素膜的X射線衍射分析Fig.8 X-ray diffraction curves of SF membrane

4 結(jié)論

通過交聯(lián)前后絲素溶液吸光度的變化，優(yōu)選出酪氨酸酶催化絲素蛋白溶液交聯(lián)反應(yīng)的最佳工藝為:酪氨酸酶用量4 000 U/g，反應(yīng)溫度45℃，反應(yīng)時間120 min。并用流延法制得了交聯(lián)絲素蛋白膜，對所成膜的24 h熱水溶失率和膜的力學(xué)性能進(jìn)行了測試，對照交聯(lián)與未交聯(lián)的絲素膜，膜的熱水溶失率和力學(xué)性能有較大改善。膜的氨基酸含量分析結(jié)果表明交聯(lián)前后絲素膜中的酪氨酸含量減少，證明酪氨酸酶可催化其發(fā)生反應(yīng)。X射線衍射結(jié)果表明交聯(lián)絲素膜仍以無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)為主，與未經(jīng)交聯(lián)的絲素膜相比，聚集態(tài)結(jié)構(gòu)無顯著變化。綜合以上分析可知，酪氨酸酶可以催化絲素大分子間的交聯(lián)反應(yīng)。

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