基于松屬不同樹種EST序列的馬尾松SSR引物開發(fā)

王曉鋒， 季孔庶， 何衛(wèi)龍

(1.南京林業(yè)大學(xué)， 江蘇 南京 210037； 2.湖南省林業(yè)科學(xué)院， 湖南 長沙 410004)

基于松屬不同樹種EST序列的馬尾松SSR引物開發(fā)

王曉鋒1,2， 季孔庶1， 何衛(wèi)龍1

(1.南京林業(yè)大學(xué)， 江蘇 南京 210037； 2.湖南省林業(yè)科學(xué)院， 湖南 長沙 410004)

利用松屬5個(gè)樹種的EST序列，分別樹種查找SSR位點(diǎn)，采用Primer3.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)的5個(gè)樹種的EST-SSR引物中：所占比例最高的均為三核苷酸重復(fù)，其次是六核苷酸重復(fù)，兩者之和都達(dá)到了64%以上；四核苷酸重復(fù)所占比例均為最低。從設(shè)計(jì)的引物中分別不同樹種各選取20對進(jìn)行引物合成和通用性檢測以及馬尾松群體檢測，結(jié)果表明：松屬5個(gè)樹種的EST序列開發(fā)的馬尾松SSR引物，其在馬尾松中的擴(kuò)增成功率為60%～80%；最高的是輻射松，最低的是海岸松，平均為72%。通用性最好的為輻射松，屬內(nèi)的通用性為94%；屬間和科間通用性也分別達(dá)到75%和44%。不同樹種序列來源的EST-SSR引物，其擴(kuò)增成功率在10%～30%；最高的是北美短葉松，其次是輻射松，最低的是扭葉松和火炬松；平均為17%。

松屬； 馬尾松； EST； SSR

馬尾松(PinusmassonianaLamb.)是松科(Pinaceae)松屬(Pinus)的多年生常綠樹種，也是我國南方荒山綠化和工業(yè)用材的重要樹種。分子標(biāo)記輔助育種是解決馬尾松育種中一些技術(shù)難題的重要途徑，可以顯著縮短育種周期[1]。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性遺傳等特點(diǎn)，已成為一種人們推崇的分子標(biāo)記方法。馬尾松SSR引物開發(fā)已有報(bào)道，如李炟[2]采用磁珠富集法開發(fā)了17對有多態(tài)性的SSR引物。但這種基因組來源的SSR引物開發(fā)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本高，難以滿足馬尾松分子標(biāo)記及相關(guān)研究的需求，因此，尋求更好的方法極有必要。近年來，隨著網(wǎng)上公共數(shù)據(jù)庫中EST序列的快速增長，為SSR引物開發(fā)提供了豐富的資源。EST-SSR具有SSR標(biāo)記的特點(diǎn)，如共顯性遺傳、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富等，同時(shí)，還具有其自身的特性： ①屬功能性分子標(biāo)記，來自表達(dá)的基因，可能與控制某一性狀的基因相關(guān)。 ②通用性好。其兩端的序列保守性高，在不同物種之間具有較高的通用性。在親緣物種之間矯正基因組連鎖圖譜和比較作圖方面有很高的利用價(jià)值[3]。 ③開發(fā)過程簡單、快速、成本低。目前許多樹種如楊樹[4]、桉樹[5]、鵝掌楸[6]、松樹[7-9]等已開發(fā)出了EST-SSR引物，并應(yīng)用于遺傳作圖、遺傳多樣性分析、分子系統(tǒng)進(jìn)化等研究[10-12]。松樹是林木中為數(shù)不多的EST序列十分豐富的樹種。劉公秉[7]利用松屬EST序列開發(fā)了39對馬尾松SSR引物。閻毛毛[9]利用松屬1萬條EST序列開發(fā)了12對在馬尾松和黃山松上表現(xiàn)多態(tài)性的SSR引物。我們利用松屬5個(gè)樹種的EST序列分別開發(fā)馬尾松的SSR引物，并檢測其在松屬內(nèi)、屬間和科間的通用性，以比較不同樹種來源的EST序列開發(fā)得到的SSR引物對馬尾松的成功擴(kuò)增率和在其他樹種上的通用性之間的差異，為以后松屬或近緣樹種通用性引物的開發(fā)、比較基因組研究提供重要的信息。

1 材料與方法

1.1材料

馬尾松球果采自福建省龍巖市上杭縣白沙林場的馬尾松實(shí)生種子園。同時(shí)，還選用了本試驗(yàn)室收集的松屬中扭葉松、濕地松、樟子松、高山松以及落葉松屬的落葉松和杉科的杉木、柳杉種子。

將種子置于人工氣候箱里發(fā)芽。氣候箱條件設(shè)為

16h光照，溫度為22℃。培養(yǎng)2周左右，取幼苗作為初篩材料。進(jìn)行引物群體檢測的胚乳材料取自馬尾松實(shí)生種子園的1個(gè)家系種子。將種子置于人工氣候箱培養(yǎng)4～5d，待其萌動(dòng)時(shí)，剝?nèi)シN皮和胚，挑取胚乳，放入2mL離心管中備用。

1.2基因組DNA提取

基因組DNA的提取采用改進(jìn)的CTAB-SDS法[13]。

1.3序列搜索及SSR位點(diǎn)查找

登陸NCBI的dbEST數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index. html)，以Pinus為關(guān)鍵詞搜索EST序列。選擇其中植物EST序列，分別不同樹種(火炬松、扭葉松、北美短葉松、海岸松、輻射松)下載。獲得松屬EST序列454455條，其中火炬松328662條、扭葉松40483條、北美短葉松36379條、海岸松34061條、輻射松8717條(截止2011年4月)。

SSR位點(diǎn)查找采用MISA程序(http://www. pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)，設(shè)定MISA配置文件(misa.ini)中SSR查找參數(shù)。查找參數(shù)分別為二核苷酸重復(fù)不少于9次，三核苷酸重復(fù)不少于6次，四核苷酸重復(fù)不少于5次，五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)不少于4次。

1.4SSR引物設(shè)計(jì)及合成

SSR引物設(shè)計(jì)采用Primer3.0程序(http://frodo.wi.mit.edu/primer3)。引物設(shè)計(jì)原則為：引物長度18～24bp；Tm值為50～60℃，上下游引物的Tm值相差不大于5℃；GC含量40%～60%，最適為50%；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小100～300bp；SSR位點(diǎn)的開始和結(jié)束位置距離5’和3’端均不少于30bp；引物采用位于SSR上游和下游各150個(gè)堿基范圍內(nèi)的序列；避免引物二級結(jié)構(gòu)以及6個(gè)連續(xù)堿基配對的出現(xiàn)。設(shè)計(jì)完成后，送往上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.5SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)

1.5.1 SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 馬尾松SSR引物PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系見表1。

表1 SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Tab1 ConentsofSSR?PCRamplification反應(yīng)成分體積最終濃度模板DNA1μLstock20ng10×PCRBuffer(Mg2+free)1μLof10×stock1×PCRBufferMg2+08μLof25mMstock2mMdNTP12μLof25mM03mMTaqDNA聚合酶016μL5units/μLstock08units上游引物015μLof10μMstock015μM下游引物015μLof10μMstock015μMddH2O63μL

1.5.2 SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序 馬尾松SSR引物PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序見表2。

1.6引物的篩選及通用性檢測

將擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，挑選出有擴(kuò)增條帶的引物。對挑選出的引物，采用松屬5個(gè)種、落葉松屬1個(gè)種、杉科2個(gè)種進(jìn)行通用性檢測。

表2 SSR—PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序Tab2 ProcedureofSSR?PCRamplification反應(yīng)程序循環(huán)次數(shù)溫度(℃)時(shí)間預(yù)變性1cyc944min9430sec梯度降溫?cái)U(kuò)增20cyc60(-05℃/cyc)30sec7230sec9430sec一般性擴(kuò)增20cyc5030sec7230sec延伸1cyc7210min保存4forever

1.7引物群體篩選

隨機(jī)選取馬尾松1個(gè)家系的8粒種子的胚乳，對有擴(kuò)增條帶的引物進(jìn)行群體篩選，采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1SSR引物設(shè)計(jì)及特征分布

采用當(dāng)前常用的Primer 3.0軟件分別對松屬5個(gè)樹種中檢索到的EST-SSR進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，然后按照不同重復(fù)基元長度加以統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表3。

表3中數(shù)據(jù)顯示：設(shè)計(jì)的100對北美短葉松引物中，三核苷酸重復(fù)所占比例最高，為68%；其次是六核苷酸重復(fù)，為17%；三核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)共占85%；四核苷酸重復(fù)和五核苷酸重復(fù)較少，分別為5%和3%。設(shè)計(jì)的20對輻射松引物中，三核苷酸重復(fù)所占比例最高，為40%；六核苷酸重復(fù)僅次于三核苷酸重復(fù)，為35%；三核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)之和為75%；所占比例最低的為四核苷酸和五核苷酸重復(fù)，均為0。設(shè)計(jì)的116對海岸松引物中，三核苷酸重復(fù)所占比例最高，為37.07%；其次是六核苷酸重復(fù)，為29.31%；三核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)之和為66.38%；最少的為四核苷酸重復(fù)，僅為5.17%。扭葉松也有類似的規(guī)律，在設(shè)計(jì)的85對引物中，所占比例最高的為三核苷酸重復(fù)，達(dá)到54.12%；其次是六核苷酸重復(fù)，為25.88%；三核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)共占到80%；比例最低的為四核苷酸重復(fù)，為2.35%?；鹁嫠稍O(shè)計(jì)出1142對引物，其中三核苷酸重復(fù)所占比例最高，為42.12%；其次是六核苷酸重復(fù)，為22.59%；三核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)之和為64.71%；四核苷酸重復(fù)比例最低，僅為1.75%。

以上結(jié)果表明：設(shè)計(jì)的松屬5個(gè)樹種的引物中，所占比例最高的均為三核苷酸重復(fù)，其次是六核苷酸重復(fù)，兩者之和都達(dá)到64%以上；而四核苷酸重復(fù)所占比例均為最低。研究發(fā)現(xiàn)，SSR重復(fù)基元的長度與其多態(tài)性有關(guān)。由短重復(fù)基元組成的SSR獲得(或失去)重復(fù)基元的速率要比長重復(fù)基元組成的SSR快，將具有更高的多態(tài)性[5]。

表3 松屬不同樹種EST—SSR引物設(shè)計(jì)及特征分布Tab3 DesigningtheEST?SSRprimersofPinusspeciesandanalyzingthedistributionofthem重復(fù)基元長度北美短葉松輻射松海岸松扭葉松火炬松引物數(shù)(對)百分比(%)引物數(shù)(對)百分比(%)引物數(shù)(對)百分比(%)引物數(shù)(對)百分比(%)引物數(shù)(對)百分比(%)二核苷酸77005250024206944712051795三核苷酸686800840004337074654124824221四核苷酸550000006517223520175五核苷酸3300000097761112941771550六核苷酸171700735003429312225882582259總計(jì)10010020100116100851001142100

2.2引物篩選及通用性檢測

分別不同樹種對設(shè)計(jì)的SSR引物各選取20對(共計(jì)100對)進(jìn)行合成，并進(jìn)行引物篩選及通用性檢測。結(jié)果見表4。

表4 SSR引物篩選及通用性檢測Tab4 ScreeningtheSSRprimersanddetectingthetransferabilityofthem樹種引物對數(shù)擴(kuò)增數(shù)(對)百分比(%)屬內(nèi)通用性屬間通用性科間通用性通用數(shù)(對)百分比(%)通用數(shù)(對)百分率(%)通用數(shù)(對)百分比(%)北美短葉松20147014100750536輻射松20168015941275744海岸松2012601192542325扭葉松2015751387853213火炬松201575128053317平均值2014472139074513625

引物初篩采用馬尾松1個(gè)家系種子培養(yǎng)的幼苗提取DNA進(jìn)行檢測。表4中數(shù)據(jù)顯示，設(shè)計(jì)的各樹種的20對SSR引物中，北美短葉松的14對可以在馬尾松中成功擴(kuò)增，擴(kuò)增率為70%；輻射松的20對引物中有16對成功擴(kuò)增，擴(kuò)增率達(dá)到80%；海岸松、扭葉松、火炬松的擴(kuò)增率分別為60%、75%、75%。SSR引物擴(kuò)增成功率最高的為輻射松，其次是扭葉松、火炬松，最低的為海岸松。松屬5個(gè)樹種開發(fā)的馬尾松SSR引物擴(kuò)增成功率平均為72%，說明用松屬EST序列開發(fā)馬尾松SSR引物的效率很高。這一結(jié)果與閻毛毛[9]所報(bào)道的72.4%基本一致。

利用松屬5個(gè)種、屬間的落葉松屬1個(gè)種、科間的杉科2個(gè)種，檢測成功擴(kuò)增的SSR引物的通用性。結(jié)果顯示：松屬5個(gè)樹種開發(fā)的馬尾松SSR引物在屬內(nèi)的通用性為80%～100%，平均達(dá)90%，說明初篩出的馬尾松SSR引物具有很高的屬內(nèi)通用性；屬間通用性為42%～75%，平均為51%，說明篩選出的馬尾松SSR引物也具有較高的屬間通用性；科間通用性為7%～44%，最高的為輻射松，達(dá)到44%；其次是北美短葉松，也達(dá)36%；平均為25%。以上結(jié)果表明，從松屬EST序列開發(fā)的馬尾松SSR引物具有很好的通用性，尤其是從輻射松的序列開發(fā)的SSR引物，屬內(nèi)的通用性為94%，屬間和科間的也分別達(dá)到75%和44%；從北美短葉松的序列開發(fā)的SSR引物，屬內(nèi)通用性達(dá)到100%，屬間和科間的分別為50%和36%；通用性最差的是火炬松序列開發(fā)的引物。SSR引物通用性可以反映不同樹種之間基因組的差別及親緣關(guān)系，在開發(fā)引物時(shí)選擇與開發(fā)樹種基因組接近、親緣關(guān)系近的植物的EST序列，可提高其效率。

2.3引物群體篩選

利用初篩出來的引物，隨機(jī)選取馬尾松1個(gè)家系的8粒種子的胚乳進(jìn)行群體檢測，篩選出擴(kuò)增條帶清晰的引物。馬尾松胚乳為單倍體，在每1個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出來的等位基因與該位點(diǎn)是一一對應(yīng)的，方便了后期遺傳圖譜構(gòu)建中擴(kuò)增條帶的判讀。篩選結(jié)果見表5。

表5 SSR引物群體篩選Tab5 ScreeningtheSSRprimerswithgroup樹種引物對數(shù)擴(kuò)增數(shù)(對)群體擴(kuò)增數(shù)(對)百分比(%)北美短葉松2014630輻射松2016420海岸松2012315扭葉松2015210火炬松2015210平均值20144317

表5結(jié)果顯示：利用松屬5個(gè)樹種的EST序列開發(fā)的馬尾松SSR引物的群體擴(kuò)增比率平均為17%，合成的各樹種的20對引物中，北美短葉松的有6對具有清晰的群體擴(kuò)增帶型，比率最高，達(dá)到30%；其次是輻射松，擴(kuò)增條帶好的有4對引物，比率為20%；比率最低的為扭葉松和火炬松，僅有2對，比率僅為10%。這一結(jié)果低于其他樹種的有關(guān)報(bào)道，如胥猛[6]報(bào)道的鵝掌楸EST-SSR的多態(tài)性比率為37.5%，但是高于貫春雨[8]的落葉松EST-SSR的多態(tài)性比率(僅為4.8%)；也高于閻毛毛[9]的松屬的結(jié)果。該結(jié)果與劉公秉[8]研究的馬尾松的結(jié)果(其群體擴(kuò)增率為28.9%)基本相似。以上結(jié)果表明，利用松屬不同樹種EST序列開發(fā)馬尾松SSR引物的群體擴(kuò)增比率是有差別的。

3 結(jié)論與討論

通過松屬5個(gè)樹種的EST序列開發(fā)馬尾松SSR引物，其擴(kuò)增成功率平均為72%。經(jīng)通用性檢測發(fā)現(xiàn)，這些引物在松屬內(nèi)具有很高的通用性，平均達(dá)到90%；在屬間和科間也具有較高的通用性，分別為51%和25%。不同樹種的引物，在馬尾松中的擴(kuò)增成功率不同，最高的為輻射松，達(dá)到了80%；其次是扭葉松和火炬松，均為75%；最低的為海岸松，為60%。群體擴(kuò)增成功率最高的是北美短葉松，達(dá)到30%；其次是輻射松，為20%；最低的是扭葉松和火炬松，僅為10%。松屬內(nèi)通用性最高的是北美短葉松，達(dá)到了100%；其次是輻射松，為94%；最低的是火炬松，為80%。屬間和科間通用性最高的均為輻射松，分別為75%和44%；最低的均為火炬松，分別為33%和7%。閻毛毛[9]是利用松屬樹種混合的EST序列開發(fā)馬尾松和黃山松SSR引物，其中90%具有屬內(nèi)通用性，與本研究的結(jié)論一致；30%具有屬間通用性，比本研究的結(jié)果明顯低，說明序列來源不同，開發(fā)出來的EST-SSR引物的通用性也不同。對比其他樹種，胥猛[6]從鵝掌楸EST序列中開發(fā)的SSR引物，有85%在中國馬褂木中有擴(kuò)增(為屬內(nèi)的通用性)，比松屬的略低，54%在白玉蘭中有擴(kuò)增(為屬間的通用性)，比松屬的略高。這對人們開發(fā)馬尾松EST-SSR引物以及松屬通用性引物具有一定的借鑒。同時(shí)，也為松屬不同樹種比較基因組的研究提供了重要信息。

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(文字編校：唐效蓉)

DevelopmentoftheSSRprimersforPinusmassonianabasedontheESTsequencesfromPinusspecies

WANG Xiaofeng1,2， JI Kongshu1，HE Weilong1

(1.Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China;2.Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, China)

The EST sequences from 5 species (P.banksiana,P.radiata,P.pinaster,P.contortaandP.taeda) ofPinuswere analyzed and the SSR locus were found respectively, and the primers of the SSR found above were designed using Primer 3.0 software. The types of EST-SSR primers designed from the 5 species ofPinuswere compared and it showed that trinucleotide repeat had the highest proportion in all species, followed by hexanucleotide repeat, and the sum of them reached to 64%, the lowest was tetranucleotide repeat. 20 pairs of SSR primers of each species were selected to detect the transferability and the rate of success amplification inP.massoniana. The results showed that the rate of success amplification was 60%～80% for primers designed from the 5 species ofPinus, the highest rate of success amplification wasP.radiata, the lowest wasP.pinaster, and the average rate was 72%. The best transferability inPinuswasP.radiata, with the transferability of 94%, and the transferability in intergeneric and interfamilial were 75% and 44% respectively. The EST-SSR primers designed by sequences from different species were tested inP.massonianagroups, it showed that the amplification rate was 10%～30%, the highest wasP.banksiana, followed byP.radiata, the lowest wereP.contortaandP.taeda, and the average rate was 17%.

Pinus;Pinusmassoniana; EST; SSR

2012-12-20

2013-01-20

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助(201104010)；國家“十二五”科技支撐項(xiàng)目(2012BAD01B02)和江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目資助。

王曉峰(1986-)，男，河南省鞏義市人，碩士，主要從事林木遺傳育種研究工作。

S 791.248

A

1003-5710(2013)01-0014-04

10. 3969/j. issn. 1003-5710. 2013. 01. 004