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    發(fā)酵法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉工藝的優(yōu)化

    2013-11-15 00:50:44
    武漢紡織大學(xué)學(xué)報 2013年6期
    關(guān)鍵詞:黑曲霉菌體發(fā)酵液

    陳 芬

    (武漢職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院,湖北 武漢 430074)

    葡萄糖酸鈉又稱五羥基己酸鈉, 是一種白色或淡黃色結(jié)晶粉末, 易溶于水, 微溶于醇, 不溶于醚。其分子式為C6H11O7Na, 相對分子質(zhì)量為218. 14[1]。葡萄糖酸鈉是合成葡萄糖酸鹽的中間體,同時自身具有優(yōu)良的螯合作用,在食品工業(yè)可用作食品添加劑、營養(yǎng)增補劑、食品保鮮劑、品質(zhì)改良劑等[2],也可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工和建筑等方面,葡萄糖酸鈉市場潛力巨大。

    目前葡萄糖酸鈉的生產(chǎn)方法主要有生物發(fā)酵法、催化氧化法和電解氧化法[2-4]等。生物發(fā)酵法[5-7]逐漸成為主要的葡萄糖酸鈉生產(chǎn)方法。該方法是利用葡萄糖經(jīng)過黑曲霉產(chǎn)的葡萄糖氧化酶簡單的脫氫作用而得到葡萄糖酸內(nèi)酯和雙氧水,再經(jīng)過進一步水解為葡萄糖酸,雙氧水經(jīng)過水解作用轉(zhuǎn)化為水和氧,同時添加一定量的氫氧化鈉溶液保持一定的pH值而得到葡萄糖酸鈉,若用碳酸鈣來調(diào)節(jié)pH,則產(chǎn)物的形式為葡萄糖酸鈣。在黑曲霉發(fā)酵葡萄糖過程中,發(fā)酵條件影響葡萄糖酸鈉的得率。本研究通過工藝優(yōu)化,創(chuàng)造適合菌體生長和生物代謝的最佳條件,充分發(fā)揮菌種的生產(chǎn)潛力,從而顯著提高發(fā)酵產(chǎn)量,為黑曲霉發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)葡萄糖酸鈉提供相應(yīng)的工藝參數(shù),以期進一步提高生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)成本。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 原料 葡萄糖:上海秉奇化工科技有限公司生產(chǎn)。營養(yǎng)瓊脂

    1.1.2 菌種 從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)購得的黑曲霉菌種2089。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    斜面培養(yǎng)基:葡萄糖8g/L,酵母膏2g/L,蛋白胨2g/L,MgS040.2g/L,NaH2P040.1g/L,KH2P040.1g/L MnS040.01g/L,瓊脂1.5g/L。

    種子培養(yǎng)基:葡萄糖60 g/L,MgS04,0.02 g/L,NaH2P040.1 g/L,KH2P040.1 g/L,MnS04100.01 g/L。

    發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖100g/L,MgS040.03 g/L,KH2P040.29/L,(NH4)2HP04,0.9g/L,MnS040.06g/L,CaC0326g/L。滅菌后接入菌種,振蕩培養(yǎng)。

    1.1.4 儀器

    恒溫調(diào)速搖床、pH計、電爐、電熱培養(yǎng)箱、無菌操作臺、電子天平、722s型分光光度計。

    1.1.5 試劑

    葡萄糖酸鈉、硫酸銅、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、碳酸鈣、氫氧化鈉。試劑均為分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 培養(yǎng)方法

    斜面培養(yǎng):將保藏管中的菌種接種于斜面培養(yǎng)基上,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng),28℃,培養(yǎng)72小時。

    種子培養(yǎng):取新鮮的斜面活化菌種,在無菌操作臺上用接種環(huán)刮下菌體接種于裝有100mL 種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中,培養(yǎng)24小時,搖床220r/min,30℃。

    發(fā)酵培養(yǎng):將一定量種子液接種到裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中,用不同的培養(yǎng)24小時,搖床220r/min,30℃。

    1.2.2 葡萄糖濃度的測定方法——用DNS法

    DNS試劑的配制:將6.3 g 3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶于少量熱蒸餾水中,加入2mol/L NaOH溶液262mL,加入192g酒石酸鉀鈉, 5.0g亞硫酸鈉,加熱攪拌溶解,冷卻后定容至1000mL容量瓶中,保存于棕色瓶中,一周后使用。

    配制1.0mg/mL葡萄糖標準溶液。

    葡萄糖標準曲線的繪制:分別取0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.00mL葡萄糖標準溶液于6支25mL的具塞試管中,分別加入DNS試劑2.0mL,于沸水浴中加熱2min進行顯色,取出后用流水迅速冷卻,各加入蒸餾水9.0mL,搖勻,在540nm處測定吸光度,繪制標準曲線。

    1.2.3 發(fā)酵過程中葡萄糖酸鈉的測定——用分光光度法

    配制0.1mol/L葡萄糖酸鈉標準溶液和0.1mol/L硫酸銅溶液。

    葡萄糖酸鈉標準曲線的繪制:分別取0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10mL葡萄糖酸鈉標準溶液于11支50mL的具塞試管中,分別加入10mL硫酸銅溶液,蒸餾水定容,沸水中加熱3分鐘,取出用自來水沖洗試管外部使其迅速冷卻至室溫,722s型分光光度計在700nm波長下,以不加葡萄糖酸鈉的溶液作空白,測其吸光度,繪制標準曲線。

    1.2.4 菌體量的測定方法

    取100mL培養(yǎng)液,過濾,用蒸餾水洗至中性,在80℃下烘干8小時至恒重,冷卻至室溫測定其質(zhì)量。

    1.2.5 黑曲霉發(fā)酵葡萄糖條件的優(yōu)化

    發(fā)酵條件的優(yōu)化是改變培養(yǎng)基的組成、改變接種量及發(fā)酵時間、在發(fā)酵過程中改變培養(yǎng)溫度、通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、調(diào)節(jié)pH等措施,從而強化微生物的生物合成的全過程,提高發(fā)酵產(chǎn)量。通過工藝條件優(yōu)化,創(chuàng)造適合菌體生長和生物代謝的最佳條件,充分發(fā)揮菌種的生產(chǎn)潛力,從而顯著提高發(fā)酵產(chǎn)量。

    在實際的生產(chǎn)中,影響黑曲霉發(fā)酵的主要因素有葡萄糖濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量、充氧量和pH等。

    本實驗選擇了影響微生物發(fā)酵的三個主要因素:發(fā)酵時間、溫度、和黑曲霉的接種量。分別測定20小時內(nèi)發(fā)酵液中殘?zhí)橇颗c菌體濃度,確定三個因素對發(fā)酵的影響,得到最佳優(yōu)化工藝。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 葡萄糖的起始濃度對菌體發(fā)酵的影響

    通過考察葡萄糖的起始濃度分別為60g/L、80g/L、100 g/L、120g/L,發(fā)酵20h時,測定葡萄糖酸鈉的產(chǎn)量,結(jié)果如圖1。

    圖1 葡萄糖不同初始濃度對產(chǎn)葡萄酸鈉的影響

    圖2 pH值對葡萄糖酸鈉含量的影響

    從圖1可以看出,葡萄糖最佳起始濃度為100g/L左右,在這種條件下,葡萄糖酸鈉的產(chǎn)量可達到85g/L以上。

    在整個發(fā)酵過程中,葡萄糖一部分被用于菌體生長和維持等生理代謝過程,另一部分則被菌體代謝過程中產(chǎn)生的葡萄糖氧化酶催化生成預(yù)期產(chǎn)物。由于葡萄糖經(jīng)葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸的過程需要氧氣的參與,因而決定了氧氣在黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖酸工藝過程的中心地位。黑曲霉發(fā)酵對葡萄糖濃度度要求高,當葡萄糖濃度較低時,發(fā)酵液中的溶氧水平較高,反應(yīng)速度較快,但葡萄糖濃度太低,生產(chǎn)量小。而當葡萄糖濃度增加時,隨著反應(yīng)的進行,蛋白質(zhì)的濃度降低,當發(fā)酵液中有Ca2+時,生成的鈣鹽就會結(jié)晶析出,將導(dǎo)致系統(tǒng)溶氧的降低而使黒曲霉產(chǎn)酶速度變慢甚至停滯。

    2.2 pH對菌體發(fā)酵的影響

    微生物的生長及產(chǎn)物的形成必須進行多種多樣的酶催化反應(yīng),pH的變化會引起各種酶活力的改變,對菌體形態(tài)和代謝途徑影響很大。黑曲霉可產(chǎn)生多種弱有機酸,如檸檬酸,葡萄糖酸,草酸等,這些有機酸的生產(chǎn)取決于反應(yīng)液的pH。當pH低于3.5時可推動TCA循環(huán),從而產(chǎn)生檸檬酸,葡萄糖酸鈉的產(chǎn)量很低。pH在4.5到8時,可產(chǎn)生葡萄糖酸。本實驗控制pH值從3-9,分別發(fā)酵20h, 觀察葡萄酸鈉的產(chǎn)量,結(jié)果如圖2,將發(fā)酵液的pH值控制在7左右,產(chǎn)量最大,在實驗中通常是通過在發(fā)酵液中加入一定量的CaC03以維持黑曲霉生長發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH值的穩(wěn)定,防止由于黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酸使發(fā)酵液中pH值過低而得到檸檬酸等有機酸而降低生產(chǎn)效率。

    2.3 發(fā)酵時間對菌體發(fā)酵的影響

    通過測定發(fā)酵液中菌體含量隨時間的變化趨勢證明當發(fā)酵到20h時,發(fā)酵液中的菌體含量達到最高值,在發(fā)酵后階段,黑曲霉開始衰亡,產(chǎn)酶能力下降,酶活力也隨之逐漸降低,菌體的含量基本保持平衡。

    對發(fā)酵液每隔2小時測菌體量的變化情況,繪制菌體生長曲線,如圖3所示。

    從圖3可以看出,黑曲霉菌體在從種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)液的最初2小時中,逐漸適應(yīng)周圍的生長環(huán)境,2小時后進入對數(shù)生長期,菌體量迅速增加,直到l2小時后質(zhì)量增長變緩,菌體進入穩(wěn)定期,15小時后菌體質(zhì)量變化不大,此時發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)基本全部消耗掉,產(chǎn)酶量達最大。在發(fā)酵后階段,黑曲霉開始衰亡,產(chǎn)酶能力下降,酶活力也隨之逐漸降低。

    從圖4也可以看出黑曲霉在發(fā)酵開始階段為黑曲霉生長階段,此時菌體量增加較快,葡萄糖含量逐步下降,此時所產(chǎn)葡萄糖酸鈉增量較小,黑曲霉經(jīng)過一段時間產(chǎn)酸量增加,葡萄糖含量下降速度較快,此時菌體量變化不大,用CaCO3控制發(fā)酵液的pH值為7,并不斷攪拌,葡莓糖酸鈉產(chǎn)量增加較快,發(fā)酵至20h,發(fā)酵液中葡萄糖基本消耗,含量不足2%班,葡萄糖酸鈉的濃度基本保持平衡,此時可認為發(fā)酵結(jié)束。

    2.4 溫度對菌體生長的影響

    微生物的生長和產(chǎn)物的合成都是在各種酶的催化下進行的,溫度是保持酶活性的最重要條件,從酶促反應(yīng)動力學(xué)來看,溫度升高,酶促反應(yīng)速度加快,生長繁殖快,但溫度越高,酶失活越快,菌體易于衰老,影響產(chǎn)物生成。溫度還影響營養(yǎng)物和氧在發(fā)酵液中的溶解、菌體生物合成方向以及菌體的代謝調(diào)節(jié)。在最適溫度下,菌種可以獲得最佳的生長代謝效果,往往各種代謝途徑也比較旺盛。因此確定菌體發(fā)酵最適溫度對產(chǎn)酸量的影響至關(guān)重要。改變搖床溫度,黑曲霉在不同培養(yǎng)溫度下對發(fā)酵終結(jié)發(fā)酵液中殘?zhí)橇康挠绊懬闆r如圖5所示。

    從圖5和圖6看出,從發(fā)酵液中葡萄糖的消耗速度和黑曲霉的菌體量隨溫度的升高而增加,溫度低于30℃時發(fā)酵終結(jié)發(fā)酵液中存在一定濃度的葡萄糖,反應(yīng)不完全,黑曲霉所產(chǎn)酶活力降低,搖床溫度為30℃時,黑曲霉生長情況最好,因而最佳發(fā)酵溫度為30℃。

    2.5 接種量對菌體發(fā)酵的影響

    圖7 接種量對殘?zhí)橇康挠绊?/p>

    圖8 接種量對菌體量的影響

    接種量對黑曲霉發(fā)酵過程中有很重要的影響,接種量低會延長發(fā)酵時間,降低生產(chǎn)效率,太高會過多消耗發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)和葡萄糖,降低產(chǎn)量。因此,采用發(fā)酵培養(yǎng)基,考察了8%、10%、12%、14%不同接種量下菌體發(fā)酵情況,分別測定了接種量對發(fā)酵終結(jié)殘?zhí)橇亢途w量的影響。

    從圖7和圖8可以看出,接種量在8%時,發(fā)酵終結(jié)發(fā)酵液中有很高的殘?zhí)橇浚揖w量較小,接種量在10%以上時,發(fā)酵液中葡萄糖全部消耗,接種量高于10%時,雖然葡萄糖全部消耗,但有一部分作為黑曲霉營養(yǎng)物質(zhì)被消耗,接種量過高,發(fā)酵液中過高的菌體量反而阻止了黑曲霉的進一步生長發(fā)酵。采用較大的接種量可以縮短菌體繁殖達到高峰的時間。但如果接種量過多,營養(yǎng)物質(zhì)迅速消耗,菌體早衰,造成發(fā)酵后勁不足,從而使產(chǎn)酶量降低。而接種量過小,延長發(fā)酵周期,同時菌體的生長與產(chǎn)酶均受顯著影響,

    2.6 最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件的確定

    通過上述實驗,最后確認黑曲霉發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)葡萄糖酸鈉的最佳發(fā)酵條件葡萄糖初始濃度為100g/L,pH7,發(fā)酵溫度為30℃,發(fā)酵時間為20h,接種量10%,在此條件下發(fā)酵液葡萄糖酸鈉的含量可達85g/L以上,產(chǎn)量比其它方法都高[3]。

    3 結(jié)論

    葡萄糖酸鈉已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、建筑及化工等領(lǐng)域,近年來,隨著其用途的不斷開發(fā),葡萄糖酸鈉產(chǎn)量和需求量也不斷增加。通過黑曲霉發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)葡萄糖酸鈉逐漸成為葡萄糖酸鈉生產(chǎn)的主要方法。

    通過本試驗探究,確定了黑曲霉發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)葡萄糖酸鈉的最佳發(fā)酵條件,此條件下黑曲霉產(chǎn)葡萄糖酸鈉量最高。為黑曲霉發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)葡萄酸鈉提供了相應(yīng)的工藝參數(shù),有利于提高葡萄糖酸鈉的得率。也為進一步在發(fā)酵罐中黑曲霉發(fā)酵大量生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的研究提供參考。

    [1]周秀琴.新功能呈味調(diào)料葡萄糖酸鈉與葡萄糖酸鉀[J].江蘇調(diào)味副食品,2003,20(5):28-29.

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