甲基紫光度法測定紅霉素腸溶片中的紅霉素

陳蓮惠，簡 易，曹洪斌

（1.川北醫(yī)學院化學教研室，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學院物理教研室，四川 南充 637000）

0 引 言

紅霉素屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，作為青霉素過敏患者的替代用藥，對很多炎癥都有很好的療效，在高濃度時對某些細菌具殺菌作用，因此在臨床上應用極廣。已報道的紅霉素分析方法有微生物檢測法[1]、高效液相色譜法（HPLC）[2-3]、電化學方法[4]、荷移分光光度法[5-7]、比濁法[8-9]等。這些方法中，有的靈敏度較低不能滿足痕量分析的要求，有的操作繁瑣、儀器昂貴、成本高。因此開發(fā)簡單、快速、靈敏的測定方法有實際意義。本文提出了利用紅霉素在近中性條件下與甲基紫反應生成締合物，用分光光度計在535nm處測定其吸光度降低值，建立了新的分光光度法測定紅霉素，可用于紅霉素腸溶片中紅霉素含量的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WFJ7200分光光度計（北京宏昌信科技有限公司）；PHS-4C+酸度計（成都市方舟科技開發(fā)公司）；ML104電子天平（杭州匯爾儀器設備有限公司）。

紅霉素（Erythromycin）標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號30307-200716）；甲基紫（Methyl Violet）標準品（成都科龍化工試劑廠）；紅霉素腸溶片1（吉林省長恒藥業(yè)有限公司，國藥準字H22020606）；紅霉素腸溶片2（輔仁藥業(yè)集團有限公司，國藥準字 H20073314）；冰乙酸（A.R.）（成都市科龍化工試劑廠）；磷酸（A.R.）（武漢市化學試劑廠）；硼酸（A.R.）（中國四川成都化學試劑廠）；氫氧化鈉（A.R.）（成都市科龍化工試劑廠）；無水乙醇（成都市科龍化工試劑廠）；實驗用水皆為二次石英蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑的配制

Britton-Robinson緩沖溶液：取2.47 g硼酸、2.36 mL冰乙酸和3.92g磷酸配制成1L的水溶液，與0.2mol/L的氫氧化鈉按照一定比例混合可配制一系列不同pH值的緩沖溶液，使用時用酸度計準確測定。

甲基紫溶液：準確稱取0.05g甲基紫標準品配制成250.00mL水溶液，此時濃度為5.08×10-4mol/L，使用時用水稀釋成5.08×10-5mol/L的標準工作溶液。

紅霉素貯備液：準確稱取200.4mg的紅霉素，用無水乙醇溶解、定容，配制成100.00mL的貯備液，使用時用水稀釋成0.1mg/mL的標準工作溶液。

1.2.2 實驗操作

準確移取5.00 mL紅霉素工作液于15.00 mL比色管中，加入5.00 mL甲基紫工作溶液和2.00 mL pH 6.8的B.R.緩沖溶液，用水稀釋至刻度，搖勻，室溫下靜置30 min，以試劑空白作參比，用1 cm比色皿在535nm處測定吸光度。

2 結(jié)果和討論

2.1 檢測波長的確定

按照試驗方法顯色后，在分光光度計上分別對甲基紫-紅霉素溶液、甲基紫溶液和紅霉素溶液進行掃描，結(jié)果如圖1所示。甲基紫在可見光區(qū)有強烈的吸收，最大吸收波長在584nm；而紅霉素在可見光區(qū)無明顯吸收；在pH 6.8的B.R.緩沖溶液中，甲基紫和紅霉素生成穩(wěn)定的離子締合物，在可見光區(qū)吸光度較甲基紫有明顯增大，且增大最多時對應的波長在535nm附近，較甲基紫的最大吸收波長藍移了49nm；因此本文選擇測定波長為535nm。

2.2 反應條件的選擇

2.2.1 稀釋劑

試驗研究了甲醇、乙醇、水作溶劑定容時對顯色反應的影響，結(jié)果表明，用甲醇、乙醇和水作稀釋劑對試驗結(jié)果沒有明顯的影響。本實驗選用水作稀釋劑。

2.2.2 緩沖溶液種類及pH

圖1 吸收光譜（pH 6.8）

試驗了 HAc-NaAc、B.R.、Tris-HCl等緩沖溶液對試驗體系的影響，結(jié)果如圖2所示。用HAc-NaAc和Tris-HCl作緩沖介質(zhì)時，緩沖范圍有限，且在可使用范圍內(nèi)檢測到體系吸光度值均比B.R.緩沖溶液體系中的測定值??；當選用近中性的B.R.緩沖溶液時，反應體系的吸光度值最大。本實驗選用pH 6.8的B.R.緩沖溶液。

圖2 緩沖溶液的影響

2.2.3 顯色劑用量

按試驗方法，加入 1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00mL等不同用量的甲基紫工作液，測定吸光度，結(jié)果顯示：當顯色劑用量為5.00mL以上時，吸光度不再明顯增加。因此，本實驗選用5.00mL。

2.2.4 溫度

按試驗方法，將配制好的溶液搖勻后，置于0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100℃等不同溫度的水浴中恒溫加熱20min，冷卻到室溫，用試劑空白作參比分別測定吸光度。結(jié)果表明，室溫下反應最完全，吸光度最大。

2.2.5 顯色時間和體系穩(wěn)定性

其他反應條件不變，按試驗方法，將配制好的溶液搖勻后，在室溫條件下放置 5，10，15，20，25，30，40，50，60，80，100min 后進行測定，結(jié)果顯示：反應 30min后吸光度不再有明顯的增加。其他條件不變，將配制好的溶液從30min起，相隔不同時間測定吸光度，直到誤差大于±5%。結(jié)果顯示：從最佳反應時間起，10h內(nèi)吸光度差值非常小，體系穩(wěn)定性好。

2.2.6 共存物質(zhì)的影響

按實驗方法考察了常見8種氨基酸、維生素、糖類和無機鹽離子等共存物質(zhì)對體系RRS的影響。試驗結(jié)果見表 1。較大倍數(shù)的 NH4+，Cl-、K+、Br-、K+、HCO3-等無機離子和一定量的氨基酸、糖類均不干擾，而Bi3+、Re3+、HPO42-和強力霉素等有一定干擾。加標回收試驗（表2）也顯示藥物中的輔料對測定無影響。

表1 共存物質(zhì)的影響（紅霉素腸溶片溶液0.067mg·mL-1）

表2 樣品分析及加標回收實驗結(jié)果（n=6）

2.3 標準曲線和相關參數(shù)

準確移取一系列不同體積的紅霉素標準工作液于15.00 mL比色管中，按試驗方法測定吸光度，繪制標準曲線。結(jié)果表明：紅霉素的濃度在0.000 8～0.050 mg/mL范圍內(nèi)服從Beer定律，有很好的線性關系?；貧w方程為：A=12.336c+0.0173，r=0.9989；對15.00 mL 5.0×10-3mg/mL紅霉素連續(xù)測定6次，RSD=0.9%。方法的檢出限為0.18μg/mL（用空白加標的方法求得檢出限：將分析物紅霉素標準品配在空白溶劑中，用光度計重復測定，標準偏差的3倍所對應的濃度值為檢出限）。締合物的表觀摩爾吸光系數(shù)ε為1.63×104L/（mol/cm）。

2.4 試樣的測定

按照2010版藥典[1]，取兩個不同廠家的紅霉素腸溶片各4片，在研缽中研細，用50 mL無水乙醇，分次研磨使紅霉素腸溶片溶解，定量轉(zhuǎn)移到500 mL容量瓶中，用二次蒸餾水定容，搖勻，靜置。實驗時精密量取上清液適量，在最佳實驗條件下進行測定，同時采用在樣品中加入已知量的方法做回收試驗，結(jié)果見表2。由表2可知：用甲基紫作為顯色劑，用分光光度法可以測定紅霉素腸溶片中的紅霉素，用該法測得值與正規(guī)廠家生產(chǎn)和標示的含量基本一致；并且加標回收實驗也證明了方法可行，其穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均比較好。

3 結(jié)束語

在醫(yī)學院或藥物研究單位，研究簡便、快速、高效、靈敏、選擇性好的檢測高效廣譜抗生素紅霉素的方法具有非常重要的現(xiàn)實意義，近年來有不少的科學研究工作者都為之付出了心血和汗水。本文基于甲基紫與紅霉素的反應建立了測定紅霉素的分光光度法，該方法簡單，靈敏度較高，選擇性較好，回收率符合要求，具有一定的實用價值。

[1]國家衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].北京：化學工業(yè)出版社，2010，301.

[2]Petr M S，Lymburn M，Clear M H.High-performance liquid chromatography determing erythromycin in plasma[J].J Assoc Off Anal Chem，1987（70）：691.

[3]于慧娟，蔡友瓊，顧潤潤.高效液相色譜法測定紅霉素、甲紅霉素和羅紅霉素的研究[J].分析試驗室，2006，25（6）：63-66.

[4]Helena T，Britt-maric E.Determination of erythromycin in gastric-juice and blood plasma by liquid chromatography and electrochemical detection[J].J Chromatogr B，1995，673：81.

[5]李春香，徐婉珍，閆永勝.結(jié)晶紫-紅霉素體系電荷轉(zhuǎn)移分光光度法測定紅霉素的研究[J].藥物分析雜志，2006，26（12）：1737-1739.

[6]賈云宏，李華侃，李東輝.茜素紅的荷移反應測定紅霉素[J].數(shù)理醫(yī)藥學雜志，2003，16（1）：69-70.

[7]江虹，劉艷，湛海粼.麥迪霉素、紅霉素與茜素的分光光度分析研究[J].分析實驗室，2007，26（5）：19-22.

[8]譚俊，高勇生，郝玉有，等.比濁法測定紅霉素生物效價及其高通量測定方法探討[J].中國抗生素雜志，2009，34（3）：170-172.

[9]劉珂.比濁法自動測定紅霉素及紅霉素腸溶片的效價[J].中國藥品標準，2010，1（3）：204-206.