參麥注射液對(duì)膿毒癥模型大鼠腎臟細(xì)胞凋亡和Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)的影響

林梅瑟 葉 帆 浙江省溫州市中醫(yī)院ICU 溫州 325000

趙志光 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科

膿毒癥是由感染所致的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是危重患者主要的死亡原因，也是重癥醫(yī)學(xué)面臨的主要焦點(diǎn)和難點(diǎn)。一項(xiàng)多中心大樣本的回顧性研究顯示，42.1%的膿毒癥患者并發(fā)急性腎損傷（acute kidney injure，AKI），膿毒性AKI 患者病情更危重、病死率更高；膿毒性AKI 是高病死率及長(zhǎng)住院時(shí)間的獨(dú)立影響因素[1]。參麥注射液在臨床上廣泛應(yīng)用于危重病患者的救治，有報(bào)道參麥注射液對(duì)膿毒癥患者的肝、腎、心功能有保護(hù)作用[2]。本研究采用盲腸結(jié)扎穿刺法（cecal ligation puncture，CLP）制備大鼠膿毒癥模型，觀察參麥注射液對(duì)膿毒癥大鼠腎臟細(xì)胞凋亡影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 健康清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley 大鼠45 只，體質(zhì)量280～350g，由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SYXK（浙）2005-0061。

1.2 藥物和試劑 參麥注射液（規(guī)格：10mL/支，批號(hào)1110201，正大青春寶藥業(yè)有限公司）；Bcl-2、Bax 免疫組化試劑盒（批號(hào)MAB-0014、MAB-0254，福州邁新生物技術(shù)有限公司）；二抗為抗鼠IgG 聚合物；DAB 試劑盒（批號(hào)12120743F，福州邁新生物技術(shù)有限公司）；大鼠腎臟細(xì)胞凋亡試劑盒（批號(hào)DMK500，寶生物工程大連有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備及分組 45 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、膿毒癥模型組和參麥組，每組15 只。采用盲腸結(jié)扎穿刺法（CLP）造模：大鼠術(shù)前在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下適應(yīng)1 周，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛麻醉（3.5mL/kg），腹壁正中切開(kāi)2cm，拉出盲腸后在盲腸總長(zhǎng)度50%處結(jié)扎，用針頭在結(jié)扎線下5mm 處貫穿盲腸1 次，造成2 個(gè)漏口，回納盲腸后關(guān)腹。假手術(shù)組除不結(jié)扎和穿刺盲腸外，其余操作同膿毒癥模型組。膿毒癥模型組CLP 造模前1h 腹腔內(nèi)注射生理鹽水10mL/kg，參麥組CLP 造模前1h 腹腔內(nèi)注射參麥注射液10mL/kg。三組大鼠術(shù)后立即皮下注射50mL/kg 林格氏液抗休克治療。

2.2 標(biāo)本采集 于術(shù)后24h 予10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，打開(kāi)腹腔，分離腎臟，將一個(gè)腎臟組織迅速放入10%甲醛溶液中固定，送病理室切片做玻片制備，另一腎臟組織迅速置于冷凍管中，液氮保存待用。

2.3 腎臟細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記法（TUNEL 法）檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡。嚴(yán)格按試劑盒操作：將石蠟切片脫蠟，梯度乙醇水化；蛋白激酶K 消化后PBS 沖洗；過(guò)氧化氫阻斷后PBS 沖洗；TUNEL 反應(yīng)液37℃60min后PBS 沖洗；DAB/H2O2顯色；蘇木素復(fù)染；脫水、透明、封片。正常腎臟細(xì)胞核呈藍(lán)色，而凋亡陽(yáng)性腎臟細(xì)胞核呈棕黃色。每張切片在光學(xué)顯微鏡200 倍視野下分別隨機(jī)選擇10 個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，計(jì)算腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI），其公式為AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總觀察細(xì)胞數(shù)×100%。

2.4 腎臟細(xì)胞Bcl-2 與Bax 蛋白表達(dá) 采用免疫組化檢測(cè)。腎臟標(biāo)本用10%中性甲醛固定24h 后行常規(guī)石蠟包埋、切片，貼附于涂有多聚氨酸的載玻片上，二甲苯和乙醇脫蠟。切片脫蠟后阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，修復(fù)抗原，以羊血清工作液封閉,室溫孵育10min，然后分別加入Bcl-2 與Bax 抗體，生物素標(biāo)記二抗，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封固，光鏡下觀察。細(xì)胞漿中有棕黃色顆粒者為Bcl-2、Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。每張切片在光學(xué)顯微鏡200 倍視野下分別隨機(jī)選擇10 個(gè)區(qū)域,每個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算Bcl-2、Bax 蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞百分比。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；凋亡指數(shù)及Bcl-2 與Bax 采用非參數(shù)成組設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較的秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis H 法），組間兩兩比較用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率或頻數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 三組大鼠體質(zhì)量比較 造模型時(shí)膿毒癥模型組死亡6 只，參麥組死亡4 只，假手術(shù)組無(wú)死亡。三組大鼠體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.187，P=0.829），見(jiàn)表1。

表1 三組大鼠體質(zhì)量比較（） kg

表1 三組大鼠體質(zhì)量比較（） kg

3.2 大鼠腎臟細(xì)胞凋亡 三組均可見(jiàn)腎臟細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡多發(fā)生于腎小球細(xì)胞。膿毒癥組和參麥組腎臟細(xì)胞AI 均高于假手術(shù)組（P＜0.01），參麥組腎臟細(xì)胞AI 雖低于膿毒癥組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.084），見(jiàn)表2。

3.3 大鼠腎臟Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，膿毒癥組和參麥組腎臟細(xì)胞Bcl-2 表達(dá)下降（P＜0.01，P＜0.05），Bax 表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），Bcl-2/Bax 比值減小（P＜0.01）。與膿毒癥組比較，參麥組Bcl-2 明顯上調(diào)（P＜0.01），Bax 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），Bcl-2/Bax 比值增大（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 三組大鼠腎臟細(xì)胞AI、Bcl-2和Bax 表達(dá)量比較（） %

表2 三組大鼠腎臟細(xì)胞AI、Bcl-2和Bax 表達(dá)量比較（） %

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與膿毒癥組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

4 討論

膿毒癥細(xì)胞存在多條細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑，其中線粒體途徑是其最重要的途徑之一[3]。Bcl-2 和Bax蛋白是該途徑的重要調(diào)節(jié)因子，而B(niǎo)ax 蛋白具有促進(jìn)凋亡作用，Bcl-2 蛋白起抑制凋亡的作用。

膿毒癥是ICU 患者發(fā)生ARF 最常見(jiàn)的原因，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前比較關(guān)注的是細(xì)胞凋亡在膿毒癥腎損害中的作用。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究CLP 膿毒癥大鼠發(fā)現(xiàn)，膿毒癥出現(xiàn)后大鼠腎功能損壞、腎小管上皮細(xì)胞凋亡，免疫組化檢測(cè)Bax 蛋白表達(dá)上升，Bcl-2/Bax下降[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)增加Bcl-2 表達(dá)、抑制Bax 表達(dá)，上調(diào)bcl-2/Bax 比值，可以減少細(xì)胞凋亡[6-7]。因此，抗凋亡措施可能對(duì)膿毒癥腎功能起保護(hù)作用。新近在對(duì)軟骨細(xì)胞研究顯示參麥注射液可能通過(guò)降低促凋亡基因BaxmRNA 表達(dá)，增加凋亡抑制基因Bcl-2mRNA 的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)Bcl-2/BaxmRNA 的比例，抑制凋亡[8]。

參麥注射液是人參與麥冬制成的中藥制劑，其有效成分為人參皂苷、麥冬皂苷、麥冬黃酮及微量人參多糖和麥冬多糖，具有養(yǎng)陰生津、補(bǔ)心復(fù)脈、益氣固脫之功效，是目前對(duì)休克、心衰等急癥常用的中藥急救制劑。研究[9]發(fā)現(xiàn)，參麥注射液使脂多糖致膿毒癥大鼠的血清TNF-α 水平下降，肝、腎、肺組織SOD活性增強(qiáng)，肝、腎功能得到保護(hù)。在CLP 模型膿毒癥大鼠研究發(fā)現(xiàn)參麥注射液可顯著降低膿毒癥大鼠血清促炎性遞質(zhì)和CRP 水平，對(duì)膿毒癥具有保護(hù)作用。俞興群等[10]研究顯示，參麥注射液能顯著降低全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）氣虛血瘀證患者的C-反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子-α 和白細(xì)胞介素（IL-1β、IL-6、IL-8）水平，有效阻止SIRS 的發(fā)展與惡化。參麥注射液對(duì)膿毒癥腎臟細(xì)胞凋亡抑制作用未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究顯示，參麥注射液可以顯著上調(diào)膿毒癥大鼠腎臟細(xì)胞Bcl-2 蛋白表達(dá)、下調(diào)Bax 蛋白表達(dá)，從而對(duì)凋亡基因起調(diào)控作用。雖然注射參麥與生理鹽水的膿毒癥大鼠腎臟凋亡指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.084），但參麥組凋亡指數(shù)已呈下降趨勢(shì)。由于本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量有限，有待擴(kuò)大樣本進(jìn)一步明確參麥注射液對(duì)膿毒癥大鼠腎臟細(xì)胞凋亡抑制作用。

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