白芷醇提液中總黃酮測定方法的比較研究

★ 吳鐵松* 吳麗霞（廣東深圳市龍華新區(qū)觀瀾人民醫(yī)院藥劑科 深圳 518110）

1 前言

白芷為傘形科植物川白芷（Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm）Benth.et Hook.f）或杭白芷（Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm）Benth.et Hook.f.Var.formosana（Boiss）Shan et Yuan）的干燥根。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。《中國藥典》各個版本均有收載。白芷性溫味辛，歸胃、大腸、肺經(jīng)。具有散風除濕、通竅止痛、消腫排膿之功效，用于感冒頭痛、鼻塞、鼻淵、牙痛、白帶異常、瘡瘍腫痛等病癥[1-2]。黃酮類化合物廣泛分布在植物界中，因具有各種顯著生物活性已成為目前研究的熱點。近年來黃酮類化合物因其獨特的功效，常作為降血糖、降血脂、抗心律失常、抗氧化、增強機體免疫力的藥物予以應用[3]。白芷的化學成分主要為香豆素類和揮發(fā)油類，也含有黃酮類化合物[4]。在白芷的化學成分含量測定的研究上，近年來主要對香豆素類、揮發(fā)油類進行大量的研究，例如已報道采用薄層掃描法[5]、反相高效液相色譜法[6]、紫外分光光度法[7]、毛細管色譜法[8]等方法對白芷中一種或幾種主要香豆素含量測定。但未見有白芷的黃酮類化合物含量測定，此方面實屬空缺，值得研究。本試驗采用微波輔助提取法提取總黃酮，采用分光光度法進行測定。

2 儀器與試劑

2.1 儀器

UV-4501S型紫外可見分光光度計（天津市港東科技有限公司），電子分析天平（廈門精藝科技有限公司），電熱恒溫干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠），HH-4數(shù)顯恒溫水浴箱（上海躍進醫(yī)療器械廠），XH-100A微波快速制樣系統(tǒng)（北京祥鵠科技有限公司）。

2.2 試劑

白芷（購于樟樹中藥飲片公司，由廣東藥學院中藥學院生藥教研室鑒定）：蘆丁精品（由廣東藥學院藥物化學實驗室提供）：石油醚、無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、三氯化鋁、氫氧化鈉均為分析純。

3 方法與結果

3.1 白芷中總黃酮的乙醇提取

將5.0g原藥材粉（過40目篩）置于60%乙醇水溶液200mL中室溫浸泡2h，置于微波（溫度50度，功率500W）中提取2次，合并提取液，粗提取液經(jīng)石油醚萃取，用60%乙醇濃縮定容至100mL，作為待測液。

3.2 蘆丁對照品溶液的配制

準確稱取120℃干燥后的蘆丁對照品10.5mg，加入適量60%乙醇，稍加熱溶解，冷卻后用60%乙醇定容至100mL，搖勻備用，配成質量濃度為0.0105 mg/mL的蘆丁對照溶液。

3.3 紫外分光光度法測白芷醇提液中總黃酮

3.3.1 最大吸收峰的確定：在190-500nm波段，以1nm為間隔對蘆丁對照液和樣品進行光譜掃描如下圖1，結果蘆丁在205nm處出現(xiàn)最大吸收峰，樣品在該處也有最大吸收峰。

圖1 蘆丁對照液和白芷醇提液的紫外吸收圖

3.3.2 標準曲線的制備：精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL蘆丁對照品溶液，分別置于試管中，用體積分數(shù)為60%乙醇稀釋至10mL，搖勻。以60%乙醇為空白，在最大吸收波長處測吸光度，并以蘆丁用量（mg/ml）為橫坐標，吸光度為縱坐標作曲線，得回歸方程：Y=0.1762X+0.0108，r=0.9993。

表1 蘆丁對照品線性關系考察

圖2 不加顯色劑的蘆丁標準曲線

3.3.3 中藥白芷提取物中總黃酮含量測定：吸取1mL待測樣，用60%乙醇定容至10 mL，以60%乙醇作空白液，在205 nm處測定吸光度，并代入回歸方程計算總黃酮的含量。

3.4 絡合-分光光度法測定白芷提取物中的總黃酮含量

3.4.1 AlCl3顯色法

3.4.1.1 最大吸收峰的確定：在190-1 000nm波段，以1nm為間隔對蘆丁對照液和樣品進行光譜掃描如下圖3，結果：蘆丁約在510nm處出現(xiàn)最大吸收峰，樣品在該處也有最大吸收峰。

圖3 AlCl3顯色的蘆丁對照液和白芷醇提液紫外吸收圖

3.4.1.2 標準曲線的制備：精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁對照品溶液，分別置于6支試管中，然后分別加入定量的AlCl3溶液，并用60%乙醇稀釋至10mL。以60%乙醇為空白，在最大吸收波長處測吸光度，作出標準曲線，得回歸方程：Y=0.126X+0.022，r=0.9975

表2 AlCl3顯色的蘆丁對照品線性關系考察

圖4 AlCl3顯色的蘆丁標準曲線

3.4.1.3 樣品黃酮含量的測定：取1mL白芷醇提液，加入AlCl3溶液顯色，用60%乙醇定容至10mL，以60%乙醇為空白，測吸光度，并代入回歸方程計算總黃酮的含量。

3.4.2 Al（NO3）3顯色法

3.4.2.1 最大吸收峰的確定：在190-1 000nm波段，以1nm為間隔對蘆丁對照液和樣品進行光譜掃描如上圖3，結果蘆丁約在510nm處出現(xiàn)最大吸收峰，樣品在該處也有最大吸收峰。

3.4.2.2 標準曲線的制備：精密吸取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0 ，5.0mL蘆丁對照品溶液，分別置于試管中，均加入5%NaNO20.1mL，搖勻，放置6分鐘后均加入10%Al（NO3）30.1mL，搖勻，放置 6 分鐘，再分別加入1moL/LNaOH 3mL，搖勻，放置15分鐘，然后以50%乙醇為空白，在510nm波長處分別測定吸光度，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=0.1687X-0.0012，r=0.9972。

表3 A（lNO3）3顯色的蘆丁對照品線性關系考察

圖5 Al（NO3）3顯色的蘆丁標準曲線

3.4.2.3 樣品黃酮含量的測定：分別吸取1mL醇提液，按3.4.2.2操作，以60%乙醇作空白液，測510nm處的吸光度，并代入回歸方程計算總黃酮的含量。

3.5 實驗結果

根據(jù)以上3種方法得出實驗結果如見表4。

表4 3種方法測定結果

4 結論

由表4可知采用不加任何顯色劑的方法測得的總黃酮含量最高，可能原因是60%乙醇-水溶液使甾體、果膠、低聚糖、蹂質、色素及其他多酚類物質一起提取出來，這些雜質尤其是色素嚴重干擾測定，使得測定結果不準確。

絡合-分光光度法可以避免醇溶性有關雜質的干擾，本實驗采用了AlCl3顯色法和Al（NO3）3絡合法測定白芷醇提液中黃酮含量，由表4可知Al（NO3）3絡合法測得的總黃酮含量比AlCl3絡合法測得的總黃酮含量要高。Al（NO3）3絡合法的基本原理是先用NaNO2還原黃酮，黃酮類化合物中的3-羥基、4-羥基、5-羥基、4-羰基或鄰二位酚羥基，與Al3+進行絡合反應，最后加NaOH溶液（在堿性條件下）使黃酮類化合物開環(huán)，生成2′-羥基查耳酮紅色絡合物而顯色，從而進行顯色定量。該法源于蘆丁含量測定法，并逐步用于黃酮類化合物的測定后來發(fā)現(xiàn)這并不是黃酮類化合物的專屬反應，因為凡具有也只有具有鄰苯二羥基的物質，均能用此法進行顯色定量[9]。而AlCl3顯色法其反應原理是黃酮母核上有3-OH和或5-OH，B環(huán)上有鄰位二經(jīng)基時（這是黃酮類化合物的典型結構），AlCl3可與之生成黃色的黃酮鋁配合物[10]，從而進行顯色定量。AlCl3顯色法測定時蘆丁、桑色素等黃酮類物質反應強烈，而對酚酸、原花色素的反應很小，因此該法對黃酮類化合物的專屬性較強，適于白芷總黃酮的測定[11]。

本實驗白芷醇提液中總黃酮并未經(jīng)過純化處理，可能這些雜質能與Al（NO3）3絡合從而干擾測定。另外Al（NO3）3絡合法使用了強堿NaOH溶液，提取液中可能含有天然色素，這些色素會在堿液顯色，從而造成測定結果產(chǎn)生偏差[11]。而相對影響AlCl3顯色法的因素較少，測定結果偏差較小。兩種方法的結果分析結果相近，分別為58.6mg、60.0mg。因此采用影響因素較少的AlCl3顯色法測定結果較準確。

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