帶Myc、His標(biāo)簽的SPAG4L真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)

陳顏亮，鄭治，王劍龍，周曉哲，李艷，楊夢(mèng)，黃利華，邢曉為

1 中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院骨科，湖南 長(zhǎng)沙 410013

2 中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410013

精子發(fā)生障礙是引起男性不育的主要原因之一，在精子發(fā)生過程中，生殖細(xì)胞先后經(jīng)歷精原細(xì)胞有絲分裂階段、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂階段和精子細(xì)胞的變態(tài)成形階段，最后發(fā)育為成熟的精子[1-3]。在精子發(fā)生過程中的每個(gè)階段都會(huì)有一些特異性的基因發(fā)揮特定作用，維持精子發(fā)生這一重要生殖生理活動(dòng)[3]。

當(dāng)前國(guó)內(nèi)外的研究認(rèn)為，Y染色體上的AZF基因微缺失與男性不育有關(guān)[4–5]。除了AZF基因外，還有許多常染色體上的基因也參與精子發(fā)生過程[6–7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)新的包含SUN結(jié)構(gòu)域的蛋白家族參與精子發(fā)生過程。該蛋白家族最為明顯的特征是 C端有一個(gè)保守的SUN結(jié)構(gòu)域，靠近N端有跨膜區(qū)(TM)，TM和SUN結(jié)構(gòu)域之間有coiled-coil區(qū)[8-10]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中至少存在5種以上SUN結(jié)構(gòu)域蛋白，已報(bào)道的有 SUN1、SUN2、SUN3、SPAG4 (又稱 SUN4)和 SPAG4L(又稱 SUN5 或TSARG4)等[10]。

在前期研究中，我們從人類精子尾部基因SPAG4出發(fā)，克隆了一個(gè)與該基因同處染色體20q11.21區(qū)域的人類睪丸新基因 SPAG4L(或SUN5) (GenBank Accession No. AF401350)[11-13]。通過對(duì)不同發(fā)育階段的小鼠研究發(fā)現(xiàn)，Spag4L(或稱 SRG4)基因是一個(gè)小鼠睪丸特異性表達(dá)基因，其表達(dá)嚴(yán)格受生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控[14]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，小鼠Spag4L蛋白主要在精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞及成熟精子細(xì)胞中表達(dá)，在精原細(xì)胞中不表達(dá)[13-15]。通過對(duì) SPAG4L及其突變體的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，SPAG4L在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜表達(dá)，跨膜區(qū) (TM)和 coiled-coil區(qū)對(duì)于 SPAG4L在核膜上的定位是必需的[13]。Frohnert等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Spag4L在小鼠睪丸中有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，該蛋白在精子中介導(dǎo)核膜和頂體的連接。我們研究發(fā)現(xiàn)，Spag4L蛋白在分離的小鼠精母細(xì)胞中能夠與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物 PDI和內(nèi)核膜標(biāo)志物L(fēng)amin B1共定位。通過對(duì)減數(shù)分裂中Spag4L的表達(dá)變化進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)Spag4L 在減數(shù)分裂過程中參與胞核的遷移和核膜重塑[13]。

為了獲得 SPAG4L蛋白，前期研究中我們成功地用PQE-30對(duì)SPAG4L的C末端進(jìn)行了原核表達(dá)[16]，該蛋白可用于研究SPAG4L的C端SUN結(jié)構(gòu)域區(qū)的功能，但是不能用于研究N端SPAG4L的功能。SPAG4L是通過N端與核膜上的分子相互作用，從而滯留在核膜上。我們?cè)囉昧藥追N原核表達(dá)載體對(duì)SPAG4L N端進(jìn)行表達(dá)，均未成功。為了獲得帶有His、Myc 雙標(biāo)簽的 SPAG4L全長(zhǎng)蛋白，本研究從人睪丸cDNA中擴(kuò)增 SPAG4L開放閱讀框，構(gòu)建到pcDNA3.1/myc-His(-)A 真核表達(dá)載體的 CMV啟動(dòng)子下游，獲得 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L重組質(zhì)粒。隨后，將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入到HeLa細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后，挑取單克隆建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 SPAG4L的細(xì)胞系，該細(xì)胞系能夠表達(dá)帶有 Myc 和 6×His標(biāo)簽的 SPAG4L蛋白。通過本研究，建立穩(wěn)定表達(dá) SPAG4L全長(zhǎng)蛋白的細(xì)胞系，將為下一步進(jìn)行免疫共沉淀和pull-down實(shí)驗(yàn)提供了理想的蛋白，為深入研究SPAG4L蛋白定位在核膜上的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人睪丸cDNA、感受態(tài)細(xì)菌JMl09及HeLa細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)中心保存；Easy-A高保真PCR擴(kuò)增酶購(gòu)自 Agilent公司；SPAG4L抗體購(gòu)自ABGAB公司(用于免疫熒光)和 Proteintech 公司(用于Western blotting)；PDI 抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；G418購(gòu)自Amresco公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自 Fermentas公司；pcDNA3.1/myc-His(-)A載體購(gòu)自Invitrogen 公司；His 單克隆抗體、Myc 單克隆抗體、GAPDH 單克隆抗體、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；高糖DMEM培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司等。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增SPAG4L基因開放閱讀框

根據(jù)我們提交國(guó)際GenBank登錄的序列，用 PCRDESN軟件設(shè)計(jì)引物，在上游引物中引入酶切位點(diǎn)NheⅠ，在下游引物中引入酶切位點(diǎn)KpnⅠ，并分別在上游和下游引物的5'端加上保護(hù)堿基。10 μL PCR擴(kuò)增體系如下：10×Easy-A反應(yīng)緩沖液 1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，上、下游引物各0.1 μL，Easy-A高保真PCR擴(kuò)增酶0.2 μL，睪丸cDNA模板0.8 μL，加雙蒸水補(bǔ)充至10 μL。在PE9700型PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min 30 s；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后降至4 ℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L重組質(zhì)粒的構(gòu)建

按照參考文獻(xiàn)[10]所述方法將 PCR擴(kuò)增的SPAG4L基因片段插入到pUCm-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109后，在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。所篩選陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定后抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，亞克隆到pcDNA3.1/myc-His(-)A表達(dá)載體中。所篩選的克隆經(jīng)PCR鑒定后，抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序。

1.2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L細(xì)胞系的建立

將消化好的HeLa細(xì)胞接種6孔板，每孔接種約1×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞融合至80% 左右，按照 LipofectamineTM2000操作說明書提供的方法將 pcDNA3.1/myc-His(-)A 空質(zhì)粒和pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，24 h后，更換含有G418(800 mg/L)的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，每 3天換液一次。篩選35～40 d后，獲得G418抗性細(xì)胞克隆。檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞克隆，用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用含G418的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，觀察克隆形成情況，待克隆形成后挑單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，檢測(cè)SPAG4L的表達(dá)，最終獲得單克隆陽(yáng)性表達(dá)SPAG4L的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

1.2.4 Western blotting檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中SPAG4L蛋白的表達(dá)

按照RIPA試劑盒說明書所述方法分別提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/myc-His(-)A空質(zhì)粒和pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L的細(xì)胞總蛋白，測(cè)定濃度，經(jīng)過SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜。Western blotting檢測(cè)按照常規(guī)方法進(jìn)行。

1.2.5 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)SPAG4L表達(dá)

在 6孔板底預(yù)先放置滅菌好的潔凈蓋玻片,接種細(xì)胞，放置到在37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，取出后用D-Hanks 液洗脫3次，經(jīng)4 %多聚甲醛固定。參照我們已建立的方法進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)SPAG4L蛋白、標(biāo)簽Myc,標(biāo)簽His以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志蛋白PDI的表達(dá)[13]。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增SPAG4L基因結(jié)果

PCR擴(kuò)增 SPAG4L基因開放閱讀框，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SPAG4L基因擴(kuò)增條帶大小符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.2 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L重組質(zhì)粒的鑒定

挑取轉(zhuǎn)化了 pUCm-T-SPAG4L重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆，在含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至合適的濃度，以菌液為模板，PCR擴(kuò)增SPAG4L基因，篩選陽(yáng)性克隆。分別將6號(hào)和2號(hào)陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒DNA后測(cè)序，將測(cè)序正確的6號(hào)質(zhì)粒用NheⅠ和KpnⅠ雙酶切，回收目的基因片段，插入到同樣經(jīng)過 NheⅠ和 KpnⅠ雙酶切的pcDNA3.1/myc-His(-)A表達(dá)質(zhì)粒中，篩選陽(yáng)性克隆，用上述SPAG4L基因引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所挑選的陽(yáng)性克隆能夠擴(kuò)增出SPAG4L基因(圖 1)，隨后，抽提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和KpnⅠ進(jìn)行雙酶切分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒中所插入的SPAG4L基因片段大小正確(圖 2)。對(duì) pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L進(jìn)行雙向測(cè)序，結(jié)果表明，所插入的SPAG4L基因序列沒有發(fā)生點(diǎn)突變和移碼突變，說明重組質(zhì)粒 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L構(gòu)建成功。

圖1 PCR鑒定pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L陽(yáng)性克隆Fig. 1 Positive clones of pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L were identified by PCR. M: 1 kb ladder; 1–5:positive clones; 6: positive control; 7: H2O.

圖2 酶切鑒定pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L重組質(zhì)粒Fig. 2 Identification of recombinant plasmid pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L by enzyme digestion.M: 1 kb ladder; 1: pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L plasmid.

2.3 Western blotting檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中SPAG4L蛋白表達(dá)

我們將篩選得到的亞克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取蛋白，應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中 SPAG4L及其標(biāo)簽蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L的細(xì)胞系中，帶有Myc和His標(biāo)簽的SPAG4L蛋白能夠正確表達(dá)，蛋白大小在43 kDa左右，蛋白大小與預(yù)期相符。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了空白質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His(-)A的細(xì)胞系中，用SPAG4L、Myc、His抗體，均未在43 kDa左右處檢測(cè)到目的條帶，而內(nèi)參GAPDH蛋白在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L組和空白質(zhì)粒組均有表達(dá)(圖3)。

2.4 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

圖3 Western blotting檢測(cè)新建細(xì)胞系中SPAG4L及其標(biāo)簽蛋白的表達(dá)Fig. 3 Expression of SPAG4L and its tags was detected in stable transfected cell lines. The protein samples were obtained from HeLa cell lines stably transfected with pcDNA3.1/myc-His(-)A (Lane 1)and pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L (Lane 2).

為了觀察 SPAG4L穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中SPAG4L及其標(biāo)簽蛋白是否表達(dá)，應(yīng)用兔抗人SPAG4L抗體和Myc單克隆(小鼠來源)抗體對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SPAG4L的細(xì)胞系進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用兔抗人 SPAG4L一抗雜交后，用FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)進(jìn)行檢測(cè)，可見細(xì)胞核膜及其周圍出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)；用Myc單克隆抗體作為一抗進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，用 Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)進(jìn)行檢測(cè)，可見細(xì)胞核膜及其周圍出現(xiàn)紅色熒光信號(hào)(圖4)。由此可見，SPAG4L及其標(biāo)簽蛋白在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中能夠正確表達(dá)，即主要分布在細(xì)胞核膜及其周圍。

PDI是一種主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，大小為55 kDa的多功能蛋白，其功能是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中催化二硫鍵的形成，促使新生肽鏈成熟成有生物活性的蛋白質(zhì)。本研究中，我們將 PDI作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志蛋白與 SPAG4L在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SPAG4L的細(xì)胞系中進(jìn)行免疫共定位實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記為綠色的 SPAG4L蛋白能夠和標(biāo)記為紅色的PDI蛋白共定位，說明SPAG4L除了在核膜表達(dá)，而且還在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表達(dá)，該結(jié)果與前期本課題組研究的 SPAG4L蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果一致(圖 5)。PDI是一個(gè)多功能蛋白，SPAG4L是否與PDI相互作用，還有待于進(jìn)一步研究。

3 討論

精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程[1-2]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，SUN 蛋白(SUN1、SUN2、SUN3、SPAG4和 SPAG4L)是一類新發(fā)現(xiàn)的核膜蛋白，都參與了精子的發(fā)生[9,11,13,17-18]。

圖4 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L細(xì)胞中SPAG4L和myc蛋白表達(dá)Fig. 4 Expression of SPAG4L and myc-tag was detected in stable transfected cell lines by immunofluorescence(200×).

圖5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L的細(xì)胞中SPAG4L與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白PDI免疫共定位Fig. 5 SPAG4L colocalized with ER marker PDI by immunofluorescence in cells stably transfected with pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L (400×).

SUN1和SUN2在精子發(fā)生的整個(gè)過程中均有表達(dá)，將小鼠中Sun1基因敲除，將會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)雄性不育[17]。SUN3是一個(gè)睪丸特異性表達(dá)蛋白，能夠與Nesprin-1相互作用形成LINC復(fù)合物，將分化中的精子核與周圍的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)連接在一起，從而確保精子核能夠正確的成形和延伸，這對(duì)于精子頭部的形成至關(guān)重要[18]。SPAG4主要在睪丸和胰腺中表達(dá)[19]，該蛋白依靠亮氨酸拉鏈與人精子尾部蛋白Odf1相互作用，在精子尾部的形成以及精子運(yùn)動(dòng)方面發(fā)揮著重要作用[11]。Kracklauer等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在雄性果蠅中 Spag4對(duì)于維持中心粒與細(xì)胞核的連接是必需的，如果將 Spag4基因敲除，那么在圓形精子和長(zhǎng)形精子中細(xì)胞核將不能正確定位，出現(xiàn)核離散的現(xiàn)象，雄性果蠅出現(xiàn)不育。重新將 Spag4基因?qū)?，則生殖功能恢復(fù)，其中SUN domain對(duì)于生殖功能恢復(fù)至關(guān)重要。

SPAG4L是我們研究小組首先成功克隆的，生物信息分析結(jié)果表明，SPAG4L與SPAG4雖然同屬SUN蛋白家族，但是它們不是同一個(gè)蛋白，它們的氨基酸序列有45% 同源性。Chalmel F等[21]對(duì)精子發(fā)生中基因表達(dá)變化的研究發(fā)現(xiàn)，Spag4L基因是一個(gè)減數(shù)分裂的標(biāo)志性基因。我們研究發(fā)現(xiàn)，Spag4L基因在小鼠出生后3周開始高表達(dá)[14]。郭睿等[22]分離純化了小鼠的各級(jí)生精細(xì)胞，對(duì)Spag4L進(jìn)行了熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從粗線期精母細(xì)胞階段到長(zhǎng)形精子細(xì)胞階段Spag4L表達(dá)下調(diào)，在圓形和長(zhǎng)形精子細(xì)胞中其表達(dá)量分別下降了33%和45%。這些結(jié)果說明，在小鼠減數(shù)分裂中Spag4L蛋白發(fā)揮著重要的功能。通過對(duì) SPAG4L及其突變體的定位發(fā)現(xiàn)，SPAG4L主要定位于細(xì)胞核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。根據(jù)擴(kuò)散-滯留模型(“Diffusion-Retention” model)理論[10]，從理論上分析，SPAG4L蛋白必須與內(nèi)核膜蛋白或核質(zhì)蛋白相互作用才能保證在核膜上的錨定。

在前期研究中，我們雖然成功對(duì) SPAG4L的 C末端進(jìn)行了原核表達(dá)，但是該融合蛋白不能用于研究SPAG4L的N端功能。生物信息分析結(jié)果表明，SPAG4L C端朝向胞質(zhì)，N端朝向核質(zhì)，靠近N端的地方有跨膜區(qū)，前期研究中，我們嘗試用不同的原核表達(dá)載體對(duì) SPAG4L全長(zhǎng)進(jìn)行原核表達(dá)，結(jié)果均未成功。因此，我們嘗試將 SPAG4L放到 CMV啟動(dòng)子下游進(jìn)行表達(dá)，同時(shí)，希望所表達(dá)的融合蛋白帶有Myc和His雙標(biāo)簽，以利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。本研究中，我們選擇了真核表達(dá)載體 pcDNA3.1/myc-His(-)A，成功構(gòu)建了 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L真核表達(dá)質(zhì)粒，通過體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞，篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，這些細(xì)胞系能夠成功表達(dá)帶Myc、His標(biāo)簽的SPAG4L全長(zhǎng)蛋白。這樣，我們下一步可以通過6×His標(biāo)簽對(duì)SPAG4L融合蛋白進(jìn)行純化，通過pull-down實(shí)驗(yàn)研究篩選SPAG4L相互作用蛋白。此外，Myc標(biāo)簽還可以用于免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，為研究 SPAG4L蛋白相互作用及信號(hào)通路提供了有力的工具。

總之，我們成功構(gòu)建了帶有His、Myc雙標(biāo)簽的 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L真核表達(dá)質(zhì)粒，并成功獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/myc-His(-)A/SPAG4L的細(xì)胞系，為深入研究SPAG4L蛋白的功能及其相互作用蛋白奠定了基礎(chǔ)。

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