選擇性環(huán)氧化酶2抑制劑NS－398對(duì)胃癌細(xì)胞AGS增殖的抑制作用

胡孫寬，周 琴，林鐵素，楊云秀，潘鈺婷，陳必成，金 嶸

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院1.消化內(nèi)科，2.肝膽胰外科，4.流行病學(xué)教研室，浙江溫州 325000;3.九江市第一人民醫(yī)院ICU，江西九江 332000)

由于目前無(wú)有效的方法發(fā)現(xiàn)早期胃癌，絕大多數(shù)胃癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)入進(jìn)展期，而進(jìn)展期胃癌預(yù)后差，故急需新穎的有效的治療方案。Notch信號(hào)通路被認(rèn)為在維持干細(xì)胞和祖細(xì)胞種群在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中的平衡有重要的作用[1]。同時(shí)在多種腫瘤形成過程中，Notch信號(hào)通路也起著重要作用[2－3]。抑制Notch信號(hào)通路能抑制胃癌細(xì)胞增殖[4]。但是，Notch信號(hào)通路在胃癌形成過程中的調(diào)節(jié)機(jī)制仍尚未明了。已有研究表明，胃癌中環(huán)氧化酶(cyclooxygenase－2，COX－2)表達(dá)明顯升高，是胃癌不良預(yù)后一個(gè)獨(dú)立因素[5]。COX－2抑制劑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，并呈劑量依賴性地抑制裸鼠胃癌的生長(zhǎng)[6]。但是COX－2抑制劑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制并未完全清楚。前期研究表明，COX－2和Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch intracellular domain，NICD)在胃癌中表達(dá)呈正相關(guān)[7]。為此，本研究通過COX－2抑制劑 NS－398與胃癌細(xì)胞 AGS共培養(yǎng)，檢測(cè)AGS細(xì)胞的增殖、凋亡和Notch信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，并探討NS－398誘導(dǎo)AGS細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為胃癌基因靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

NS－398購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;F12培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素和Trizol購(gòu)自Gibco BRL公司;胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司;CCK－8試劑盒購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所。DMSO，AnnexinⅤ－FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和胰蛋白酶為Sigma公司產(chǎn)品;PCR引物(表1)由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司;SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自ABI公司;兔抗人NICD抗體和PVDF膜購(gòu)自Millipore公司;兔抗人毛蛋白和斷裂1增強(qiáng)子(hairy and enhancer of split 1，Hes－1)抗體購(gòu)自Abcam公司;兔抗人NF－κB抗體購(gòu)自Cell Signaling公司;兔抗人GAPDH抗體購(gòu)自杭州賢至生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;蛋白質(zhì)定量試劑盒和電化學(xué)發(fā)光試劑盒為美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品;X線膠片為日本柯達(dá)公司產(chǎn)品;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。ELX800酶標(biāo)儀為 Bio－Tek產(chǎn)品;ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為ABI公司產(chǎn)品。

Tab.1 Primers used for real－time PCR

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物配制

胃癌細(xì)胞AGS購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)基為含10%的胎牛血清、青霉素100 U·L－1和鏈霉素100 μg·L－1的 F12 培養(yǎng)基，培養(yǎng)在37℃，5%CO2孵箱中。2 d換液1次，3 d傳代1次。NS－398用DMSO溶解，配制成50 mmol·L－1。儲(chǔ)存在 －80℃冰箱。用無(wú)血清F12培養(yǎng)基稀釋成所需的工作濃度。

1.3 CCK－8 法檢測(cè)細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整成8 ×107L－1，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔加100 μl，常規(guī)培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁后，換無(wú)血清F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，加入不同濃度的 NS－398，使終濃度為25，50和100 μmol·L－1，并設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組(不加藥物)和空白對(duì)照組(只加培養(yǎng)基不加細(xì)胞)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)12，24和48 h后，每孔加入CCK－810 μl，2 h后用酶標(biāo)儀上在波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。胃癌細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A450nm－空白對(duì)照組A450nm)/(細(xì)胞對(duì)照組A450nm－空白對(duì)照組A450nm)×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

同樣取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×108L－1，接種于6孔培養(yǎng)板中。藥物處理和實(shí)驗(yàn)分組同上。藥物作用48 h后，收集細(xì)胞，按照AnnexinⅤ－FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Notch信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，加入NS－39850 μmol·L－1(終濃度)作用 24 h，提取總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。熒光實(shí)時(shí)定量PCR步驟參照ABI說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系共20 μl，其中 cDNA 1 μl，上下游引物各2 μl，PCR Master Mix 10 μl，去酶水 5 μl。目的基因的相對(duì)表達(dá)水平由目的基因的2－ΔΔCt/GAPDH 的2－ΔΔCt比值表示。

1.6 Western印跡法檢測(cè)Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，與NS－39850 μmol·L－1作用48 h，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。常規(guī)SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉后，加入一抗孵育(抗 NICD:1∶500，抗 Hes－1:1∶1000，抗 NF－κB2:1∶1000，抗GAPDH:1∶500)，PBS 清洗后二抗孵育，ECL 發(fā)光，暗室X線膠片曝光。掃描膠片后，使用Image J圖像分析軟件測(cè)定蛋白條帶積分吸光度(integrated absorbance，IA)，待測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)水平用IA目標(biāo)蛋白/IAGAPDH比值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NS－398對(duì)AGS細(xì)胞增殖的抑制作用

由圖1看出，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，NS－398對(duì)AGS細(xì)胞增殖的抑制作用明顯增強(qiáng)，并呈時(shí)間和濃度依賴性(圖1)。對(duì)48 h不同濃度25，50和100 μmol·L－1(x)和存活率(y)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程 y=－0.537x+77.55(r濃度=－0.999，P=0.027)，根據(jù)此公式可得 48 h的 IC50為51.34 μmol·L－1。對(duì) NS－39850 μmol·L－1與AGS細(xì)胞作用12，24和48 h(x)和存活率(y)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程 y=－1.30x+111.92(r時(shí)間=－1.00，P=0.003)。

Fig.1 Effect of NS－398 on AGS cell survival.AGS cells were treated with NS－398 and measured by CCK－8 assay.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control(0)group.

2.2 NS－398對(duì)AGS細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組早期凋亡右下象限為(3.5±1.4)%，NS－39850 μmol·L－1作用于AGS細(xì)胞48 h后，細(xì)胞早期凋亡率明顯升高，達(dá)到(20.1±3.5)%(n=3，P＜0.05)(圖2)。

Fig.2 Effect of NS－398 on apoptosis of AGS cells detected with flow cytometry.AGS cells were cultured with NS－39850 μmol·L－1for 48 h.A:normal control;B:NS－39850 μmol·L－1.

2.3 NS－398對(duì)AGS細(xì)胞Notch信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

Fig.3 Effect of NS－398 on mRNA expression of some genes related to Notch signal transduction in AGS cells.AGS cells were cultured with NS－39850 μmol·L －1for 24 h.mRNA expression was determined with real－time PCR and expressed as the ratio of 2－ΔΔCtof target gene/2－ΔΔCtof GAPDH.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

如圖3所示，NS－39850 μmol·L－1作用24 h，NF－κB2 mRNA 表達(dá)顯著低于對(duì)照組(t=5.08，P=0.007)Hes－1 mRNA 表 達(dá) 顯 著 低 于 對(duì) 照 組(t=3.4，P=0.027)。Notch 信號(hào)通路的配體鋸齒狀 1(jagged－1，JAG1)和 δ 樣 1(delta－like 1，DLL1)及Notch信號(hào)通路的受體Notch1和Notch2 mRNA表達(dá)未發(fā)現(xiàn)明顯的變化。

2.4 NS－398對(duì)AGS細(xì)胞 NICD蛋白表達(dá)的影響

NS－39850 μmol·L－1與 AGS 細(xì)胞作用 48 h，NICD，NF－κB2和Hes－1蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)(圖4)。

Fig.4 Effect of NS－398 on expression of NF－κB2，NICD and Hes－1 in AGS cells.AGS cells were cultured with NS－39850 μmo·lL－1for 48 h.The protein expression was measured with Western blotting(A)and expressed as the ratio of integrated absorbance of target protein/ingegated absorbance of GAPDH(B).Lane 1，normal control;lane 2，NS－398 group.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group.

3 討論

COX是前列腺素合成過程中非常重要的限速酶。COX－2是一種誘導(dǎo)酶，在正常生理?xiàng)l件下檢測(cè)不到其表達(dá)，只有當(dāng)受到相應(yīng)的刺激時(shí)才開始合成。以前認(rèn)為COX－2與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，目前認(rèn)為COX－2和腫瘤的發(fā)生也密切相關(guān)，其中包括胃癌。我們的前期研究已表明，COX－2表達(dá)增加與胃癌細(xì)胞分化、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，COX－2也可反映胃癌的惡性程度并提示胃癌患者的預(yù)后[7]。

Notch信號(hào)通路在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[9]，主要是通過下游靶基因產(chǎn)生生物學(xué)作用。下游的靶基因中，最為典型的靶基因?yàn)镠es和Hes相關(guān)的家族，該基因轉(zhuǎn)而調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)[10]，如Hes－1表達(dá)減少能夠促進(jìn)細(xì)胞周期依賴蛋白CDKN1C/P57的表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞衰老[11]，同時(shí)NF－κB也被證實(shí)是 Notch1 信號(hào)通路的靶基因[12]。通過用γ－分泌酶抑制劑(阻斷Notch受體激活的藥物)阻斷Notch信號(hào)通路，能夠減少結(jié)腸癌對(duì)奧沙利鉑(oxaliplatin)的耐藥性，從而促進(jìn)奧沙利鉑對(duì)結(jié)腸癌的療效[10]。抑制Notch信號(hào)通路能下調(diào)抗凋亡基因bcl-2表達(dá)，上調(diào)bax表達(dá)[13]，并且認(rèn)為抑制Notch信號(hào)通路能夠促進(jìn)P21的表達(dá)，減少周期蛋白A的表達(dá)[14]，提示抑制Notch信號(hào)通路能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此，通過抑制Notch信號(hào)通路來抑制胃癌細(xì)胞的增殖可能成為治療胃癌的有效方法。本研究結(jié)果表明，NS－398可使AGS細(xì)胞NICD表達(dá)明顯減少，提示Notch信號(hào)通路受到明顯的抑制，NS－398抑制胃癌細(xì)胞增殖可能與Notch信號(hào)通路的抑制有關(guān)。

NF－κB2作為Notch信號(hào)通路的靶基因，具有抗細(xì)胞凋亡功能，涉及多個(gè)信號(hào)通路，過程復(fù)雜，主要通過上調(diào)或者誘導(dǎo)抗凋亡基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)[15]。由于這些基因調(diào)節(jié)點(diǎn)上有NF－κB的結(jié)合位點(diǎn)，其表達(dá)產(chǎn)物通過抑制細(xì)胞凋亡的線粒體途徑或者死亡受體途徑發(fā)揮作用[16]。本研究結(jié)果表明，NS－398可使胃癌細(xì)胞AGS NF－κB2表達(dá)明顯減少，提示可能通過該途徑促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的凋亡。據(jù)報(bào)道，COX－2抑制劑治療癌癥所需的劑量比減少COX－2酶激活的劑量要少很多，從而推測(cè)該抑制劑的激活可能有多個(gè)模式[17]。曾有研究認(rèn)為，抑制COX－2主要通過抑制前列腺素的合成而阻止其生物學(xué)作用。隨后研究報(bào)道，COX－2抑制劑能通過 Fas介導(dǎo)的途徑調(diào)節(jié)PTEN－AKt通路而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果表明，NS－398能有效地抑制胃癌細(xì)胞AGS增殖，明顯減少Notch靶基因Hes－1和NF－κB2 mRNA的表達(dá)，但并不影響Notch信號(hào)的配體(DLL1和JAG1)及受體(Notch1和Notch2)mRNA的變化。Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NS－398能減少NICD，Hes－1和NF－κB2蛋白的表達(dá)。綜合上述結(jié)果提示，NS－398可能部分通過抑制 NICD的表達(dá)來阻斷Notch信號(hào)通路，減少其靶基因Hes－1和NF－κB2的表達(dá)，進(jìn)而抑制AGS細(xì)胞增殖，促進(jìn)AGS細(xì)胞凋亡。

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