當(dāng)歸總苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷的改善作用

宋書輝，于 冰，徐 旭，趙專友，湯立達(dá)

(1.天津藥物研究院釋藥技術(shù)與藥代動力學(xué)國家重點實驗室，天津 300193;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 300193)

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸〔Angelica sinensis(Oliv.)Diels〕的干燥根，味甘、辛、性溫，是常用活血化瘀中藥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其對心腦血管系統(tǒng)和血液系統(tǒng)具有廣泛的藥理效應(yīng)[1－2]。當(dāng)歸，素有“十方九歸”之稱，至今仍廣泛應(yīng)用于臨床，相關(guān)研究已證實當(dāng)歸具有抗血小板聚集作用[3－5]。大量的研究表明，當(dāng)歸對缺血組織有保護(hù)作用[6－11]。當(dāng)歸在擴張血管、抗血小板聚集、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗氧化、清除自由基和改善血液流變學(xué)等方面具有良好的藥理作用[12]。血塞通為已經(jīng)上市的并且在活血化瘀、通脈活絡(luò)、抑制血小板聚集和增加腦血流量方面的療效在臨床上已得以驗證與肯定。本研究通過對當(dāng)歸主要有效成分當(dāng)歸總苯酞(A.sinensis total phthalide，ASTP)藥理作用的探討，觀察其在大鼠腦缺血再灌注損傷方面的作用，以便為臨床應(yīng)用提供依據(jù)，并以血塞通為陽性對照藥，主要用于對實驗方法學(xué)的驗證以及與ASTP在大鼠腦缺血再灌方面的療效進(jìn)行比較和評價。

1 材料與方法

1.1 藥品和主要儀器

當(dāng)歸是由天津藥物研究院中藥現(xiàn)代研究部按照2010年版《中國藥典》一部當(dāng)歸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗，符合規(guī)定。每20 g當(dāng)歸生藥材能夠提取1 g ASTP，以1%吐溫-80配置成所需濃度的乳濁液，供大鼠灌胃用。血塞通，云南白藥集團文山七花有限責(zé)任公司產(chǎn)品，批號20091121，規(guī)格:每粒50 mg。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，Sigma公司產(chǎn)品，批號71K1225，以磷酸鹽緩沖液配制2%溶液供腦組織染色用。高分子右旋糖酐，相對分子質(zhì)量50萬，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所科技公司產(chǎn)品，批號100608，白色粉末，以生理鹽水制成10%濃度供動物靜脈注射造型用。異氟烷，分析純，每瓶100 ml，山東科源制藥有限公司，批號:20100214。吐溫-80，成都市方舟化學(xué)試劑廠，化學(xué)純，批號:20090903;丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒，南京建成生物工程研究所;PK121R低溫冷凍離心機，意大利ALC公司產(chǎn)品。COOLPIX955數(shù)碼相機，日本尼康公司產(chǎn)品。病理圖像采集與分析系統(tǒng)，北京航空航天大學(xué)圖像中心產(chǎn)品。

1.2 動物和暫時性腦缺血再灌注模型的制備

雄性SD大鼠，250～260 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號 SCXK(京)2007-0001。

60只SD大鼠，分為6組，每組10只，假手術(shù)組、模型組、陽性藥血塞通 0.05 g·kg－1組、ASTP 0.05，0.1 和0.2 g·kg－1組。假手術(shù)組和模型組分別ig給予1%吐溫-80乳濁液，給藥體積均為10 ml·kg－1，ig給藥，連續(xù)7 d。于第7天給藥30 min之后，進(jìn)行暫時性局部腦缺血模型的制備。雄性 SD大鼠，250～260 g，用 24%水合氯醛(350 mg·kg－1，ip)麻醉，之后將大鼠仰臥固定，沿頸部正中作2 cm長的皮膚切口，分離出右側(cè)頸總動脈并穿線2根備用。再分離出頸外動脈，在頸外動脈下方小心分離出頸內(nèi)動脈及翼突腭動脈，將一根直徑0.21～0.23 mm的尼龍線從頸外動脈插入，于分叉的分支處結(jié)扎即完成手術(shù)。若要進(jìn)行再灌注，則將尼龍線往回抽至頸外動脈處即可實現(xiàn)再灌[6]。

1.3 神經(jīng)功能行為學(xué)評分、腦梗死面積和腦水腫的測定

分別于再灌前、再灌2和24 h進(jìn)行神經(jīng)功能行為學(xué)評分[13]。評分后處死大鼠，取出全腦，冠狀面間隔2 mm均勻切片6片，間隔取出大腦切片4片放入2%TTC染液中，進(jìn)行染色。取大腦切片1片以“重量求面積法”計算出梗死組織重量占全腦重的百分比作為梗死面積的比例[9]。再另取大腦切片1片稱重后，置于50℃烘箱中烤至恒重，稱量其干重，計算大鼠大腦含水百分率(%)=(新鮮腦重－干燥后腦重)/新鮮腦重×100%，腦水腫抑制率(%)=實驗組大腦含水百分率－模型組大腦含水百分率/模型組大腦含水百分率×100%。

1.4 MDA含量和SOD活性的檢測

按照MDA和SOD試劑盒的說明進(jìn)行測定。

1.5 大鼠腦膜血管流量測定

動物分組及給藥方法同1.2。于第7天給藥后1 h，ip給予20%烏拉坦(1 g·kg－1)麻醉，俯臥位固定于立體定位儀上，立體定位于AP3，MR3。切開顱骨頂部皮膚暴露顱骨，用一大小約0.5 cm×0.5 cm的薄膜貼于顱骨上，其上方置激光探頭，調(diào)節(jié)探頭高度及位置，使血流量達(dá)到65～80多普勒流量單位(PU，ml·min－1)，穩(wěn)定20 min，記錄流量作為基礎(chǔ)值。然后經(jīng)股靜脈推注10%高分子右旋糖酐5 ml·kg－1造成微循環(huán)障礙;正常對照組不造型，只推注等量的生理鹽水。記錄推注10%高分子右旋糖酐后5，10，15，20，30，45，60，90和120 min的血流量值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸總苯酞對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評分的影響

表1結(jié)果顯示，再灌前，模型組及各給藥組神經(jīng)功能行為學(xué)評分均顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)，給予ASTP 0.1 和0.2 g·kg－1神經(jīng)功能行為學(xué)評分顯著低于模型組(P＜0.05)。再灌2 h 后，ASTP 0.05，0.1和0.2 g·kg－1神經(jīng)功能行為學(xué)評分分別降低 15.5%，28.7%和29.9%，再灌24 h后，神經(jīng)功能行為學(xué)評分分別降低11.9%，25.3%和37.4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。陽性對照藥血塞通也能明顯改善神經(jīng)功能障礙，與 ASTP 0.2 g·kg－1相當(dāng)。

Tab.1 Effect of Angelica sinensis total phthalide(ASTP)on neurological score in ischemia/reperfusion(I/R)rats

2.2 當(dāng)歸總苯酞對腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積的影響

圖1和表2結(jié)果顯示，與模型對照組相比，ASTP 0.1 和0.2 g·kg－1可明顯縮小腦缺血再灌注損傷所致的大鼠腦梗死面積，分別縮小41.7%和49.6%(P＜0.05)，ASTP 0.05 g·kg－1無明顯作用。

Fig.1 Effect of ASTP on cerebral infarction rats.A:sham group;B:model group;C，D and E:ASTP0.05，0.1 and 0.2 g·kg－1groups;F:Xuesaitong group.The normal tissue showed red after staining while the part of infarction showed white.

Tab.2 Effect of ASTP on rate of cerebral infarction area in I/R rats

2.3 當(dāng)歸總苯酞腦缺血再灌注大鼠腦水腫的影響

表3結(jié)果顯示，假手術(shù)組腦含水百分率為(76.3±1.1)%。與模型組相比，大鼠給予 ASTP 0.1和0.2 g·kg－1，每天1 次，連續(xù)7 d 后，可不同程度減輕腦水腫，分別減輕42%和52%(P＜0.05)，陽性對照藥血塞通使腦水腫減輕 39%(P＜0.05)。但仍舊明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)。

2.4 當(dāng)歸總苯酞對腦缺血再灌注大鼠腦脂質(zhì)過氧化的影響

表4結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組MDA含量明顯增加，而SOD活性明顯下降，表明大鼠腦缺血再灌注損傷后引發(fā)明顯腦脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。ASTP可明顯降低MDA生成，同時SOD活性有所增加;與模型對照組比較，MDA最大降低幅度達(dá)62%，SOD活性最大升高幅度達(dá)77%。

Tab.3 Effect of ASTP on brain edema in I/R rats

Tab.4 Effect of ASTP on malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)in I/R rats

2.5 當(dāng)歸總苯酞對高黏滯血癥大鼠軟腦膜微循環(huán)的影響

圖2結(jié)果顯示，造模后5 min開始，模型組PU值明顯降低(P＜0.01)。與模型組相比，給ASTP 0.05 g·kg－1組在造模后60 min開始PU值明顯升高，ASTP 0.1 和0.2 g·kg－1組從30 min 開始明顯升高(P＜0.05)，但均低于同一時間點假手術(shù)組PU值。造模后5～30 min期間，ASTP各組PU值明顯低于假手術(shù)組(P＜0.01)，從60 min開始逐漸恢復(fù)，說明給予ASTP對改善腦膜微循環(huán)有一定的作用。

Fig.2 Effect of ASTP on pial vascular blood flow(PU)in rats.See Tab.1 for the rat treatment.±s，n=10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with sham control group;#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠給予ASTP后，可以縮小造模導(dǎo)致的腦梗死體積，減輕腦水腫，改善軟腦膜微循環(huán)。當(dāng)歸具有廣泛的藥理作用，具有補血理氣之功效，其作用范圍涉及機體的多個系統(tǒng)，當(dāng)歸可以通過改善血栓素A2與前列環(huán)素之間的平衡，提高血栓素A2與前列環(huán)素的比值，抑制血小板釋放5-HT[14－15]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠腦 MDA 含量降低，SOD活性增加。文獻(xiàn)報道，當(dāng)歸具有抗氧化與抗衰老作用，可明顯提高D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠大腦皮質(zhì)SOD活性，提高Ca-ATP酶的活性，降低脂褐素含量[16－17]。說明 ASTP 通過抗氧化作用減輕腦缺血再灌注的損傷。

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