HPLC 法測定金關(guān)片中雷公藤甲素的含量

袁海英 羅德福 黎 蕓

（1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 雅安 625000；2.四川武警雅安支隊衛(wèi)生隊，四川 雅安 625000；3.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

金關(guān)片是含有雷公藤的復(fù)方制劑，具有補益肝腎，祛寒止痛，活血通絡(luò)，增強腎上腺皮質(zhì)功能，免疫調(diào)整等作用，適用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，強直性脊柱炎，增生性關(guān)節(jié)炎等病證［1］。筆者采用HPLC 法對金關(guān)片中起主要藥理作用的雷公藤甲素進行了含量分析。結(jié)果表明雷公藤甲素在此條件下分離較好，檢測靈敏度高。

1 材 料

1.1 儀器AE-240電子天平（METTLER），Agilent 1260 高效液相色譜儀，UPT-1-40L 優(yōu)普超純水器，AS20500 超聲儀（SCIENCE）。

1.2 試藥 金關(guān)片（批號：110501、120501、121001，雅安三九藥業(yè)有限公司）；雷公藤甲素（批號：1566-200201，中國藥品生物制品檢定所）；乙腈（色譜純，批號：1633930 215，Merck，）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 溶液制備［2-6］（1）對照品溶液的制備。精密稱取雷公藤甲素對照品2.50 mg 于25 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的對照品貯備液。再精密吸取此貯備液5 mL 于25 mL 容量瓶中，加甲醇定容到刻度搖勻即得濃度為0.02 mg/mL的對照品溶液。（2）供試品溶液的制備。取金關(guān)片30片，除去包衣，研細，精密稱定重量，稱取細粉約3 g，精密稱定后置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-氯仿（1∶1）50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，放置過夜，超聲處理30 min，再稱定質(zhì)量，用甲醇-氯仿（1∶1）補足減失的質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL 蒸干，殘渣加甲醇-氯仿（1∶1）3～5 mL 使溶解，加于中性氧化鋁柱（12 g，內(nèi)徑1.5 cm，濕法裝柱）上，用甲醇-氯仿（1∶3）洗脫，收集洗脫液50 mL 蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至5 mL，搖勻，濾過即得供試品溶液。

2 方法與結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 色譜柱：Waters Symmetry Shield RP18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相：乙腈-0.3%磷酸二氫鉀（23∶77）。檢測波長：220 nm；流速：1.0 mL/min。柱溫：25℃。進樣量：10 μL。在此色譜條件下，雷公藤甲素達到基線分離，理論塔板數(shù)按雷公藤甲素計不低于5000，樣品中其他成分對雷公藤甲素的測試無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC 色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察 分別吸取對照品貯備液0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2 mL，分別置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，分別吸取10uL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以對照品的進樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算得線性回歸方程為：Y=2056.8898X+0.1878，r=0.9999。結(jié)果表明雷公藤甲素在0.02～0.32 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗 分別精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄雷公藤甲素的峰面積，以峰面積計算RSD 為0.46%。

2.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取新配制的對照品溶液和新制備的供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h 進樣10 μL 測定，記錄每次測定的雷公藤甲素的峰面積，以峰面積計算對照品RSD 為1.70%，供試品RSD 為1.60%，結(jié)果表明對照品和供試品溶液在12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗 取同一批樣品，按1.3 項下方法制備5 份供試品溶液，按上述色譜條件測定。結(jié)果樣品中雷公藤甲素含量的平均值4.7 μg/片，RSD 為1.89%。

2.6 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的樣品共6份，分別精密加入雷公藤甲素對照品溶液（20.0 μg/mL）2 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算雷公藤甲素的平均加樣回收率為97.92%，RSD=1.81%，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.7 樣品含量測定 取3 批金關(guān)片樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，對照品溶液與供試品溶液分別進樣10 μL，按上述色譜條件測定，采用外標(biāo)法計算樣品中雷公藤甲素的含量。結(jié)果樣品批號為110501、120501、121001的 雷 公 藤 甲 素 含 量 分 別 為4.7、6.1、4.7 μg/片。

3 討論

金關(guān)片為雷公藤復(fù)方制劑，其療效明顯，不良反應(yīng)少，是一個不可多得具有很高價值的治療RA的藥物，本試驗采用HPLC 法，對金關(guān)片中起主要藥理作用的雷公藤甲素進行了含量測定。參照文獻［7］先將雷公藤甲素對照品溶液進行光譜檢測，其最大吸收峰在220 nm 處出現(xiàn)，故選擇220 nm 作為測定雷公藤甲素的檢測波長；再分別對流動相、色譜柱進行了篩選，本實驗結(jié)果表明：采用Waters Symmetry Shield RP18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；乙腈-0.3%磷酸二氫鉀溶液（23∶77）作流動相；檢測波長為220 nm時，供試品色譜中雷公藤甲素能得到較好的分離測定。

［1］接紅宇，吳啟富.金關(guān)片治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎47例［J］.中醫(yī)臨床研究，2012，24（4）：58-60.

［2］高麗，聶中標(biāo).不同產(chǎn)地雷公藤藥材中雷公藤甲素含量測定［J］.山西中醫(yī)，2012，28（8）：42-44.

［3］王艷芝.HPLC 法測定雷公藤片中雷公藤甲素的含量［J］.藥品鑒定，2012，7（4）：44-45.

［4］王賢英，謝香菊.中藥材火把花中雷公藤甲素及表兒茶素的含量測定［J］.重慶中草藥研究，2012，65（1）：17-19.

［5］劉建群，劉一文.HPLC 法測定江西雷公藤各部位雷公藤甲素的含量［J］.江西中醫(yī)藥，2012，43（6）：52-54.

［6］張濤，金描真.HPLC 法測定抗哮喘滴丸中雷公藤甲素的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2011，15（7）：830-831.

［7］鄧海英，康四和.高效液相色譜法測定雷公藤片中雷公藤甲素含量［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2008，27（10）：1256-1257.