輔以抗生素的牙周機械治療對伴動脈粥樣硬化牙周炎大鼠的頸動脈及血清超敏C—反應蛋白的影響

任秀云 常樂 岳姿潔 林牧 石學雪 孫麗莉

[摘要] 目的 研究伴動脈粥樣硬化（As）的慢性牙周炎（CP）大鼠模型中血清超敏C反應蛋白（hsCRP）的表達及頸動脈血管的病理變化，探討牙周基礎(chǔ)治療輔以抗生素對As的影響。方法 35只SD大鼠隨機分為兩大組：A組（正常對照）和B組（CP+As），建立CP+AS模型后再將B組分為4組，自然進程組（B1）、牙周機械治療組（B2）、機械治療+局部藥物組（B3）、機械治療+局部藥物+抗生素組（B4），每組7只，接受相應的牙周干預治療。通過酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測血清中hsCRP的質(zhì)量濃度，光鏡下觀察頸動脈血管組織的病理變化。結(jié)果 隨著時間推移，B1組hsCRP質(zhì)量濃度逐漸升高，在第2次干預后5周（第5次取樣時間點）明顯高于其他組（P<0.001）；B2、B3、B4組hsCRP先逐漸升高，在第2次干預后1周（第3次取樣時間點）達到高峰，之后逐漸下降，低于其基線水平，但仍高于A組（P<0.05）。第2次干預后3周（第4次取樣時間點）起，B3、B4組hsCRP顯著低于B2組（P<0.001）。病理結(jié)果：B1組可見炎癥細胞浸潤及大量泡沫細胞，彈性纖維明顯紊亂破壞；B2組血管壁厚薄不均，可見泡沫細胞，彈性纖維紊亂；B3組血管壁輕度增厚，彈性纖維排列較整齊；B4組血管壁厚度較均勻，彈性纖維排列整齊。結(jié)論 對于伴有As+CP的大鼠，牙周基礎(chǔ)治療短期內(nèi)可能會增加As的發(fā)展風險，而從長期作用來看可能會改善As病變；在牙周機械治療的基礎(chǔ)上增加局部抗炎、全身抗生素治療可優(yōu)化其療效。

[關(guān)鍵詞] 牙周炎； 動脈粥樣硬化； 牙周機械治療； 超敏C-反應蛋白

[中圖分類號] R 739.86 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.015

目前的研究[1]認為，牙周炎與動脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）及其危險因素之間存在復雜而廣泛的聯(lián)系。C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）是一種由肝臟產(chǎn)生的，僅在感染或非感染來源的炎癥性疾病中表達的急性期反應蛋白[2]。CRP在牙周炎患者血清中表達升高，同時也是As患者血清炎癥反應的靈敏標志物[3]。研究發(fā)現(xiàn)，超敏CRP（high-sensitivity CRP，hsCRP）≥3.0 mg·L-1者罹患包括心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）在內(nèi)的慢性感染性疾病的危險性增加，被認為是CVD的危險因素之一[3]；而牙周治療可在短期內(nèi)引起CRP升高，長期則出現(xiàn)下降的趨勢[4-5]。本研究通過建立慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）合并As的SD大鼠模型，在本課題組前期研究[6-8]的基礎(chǔ)上，加大樣本量，在牙周機械治療的基礎(chǔ)上增加局部抗炎及全身抗生素治療，采用酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法動態(tài)檢測血清中的hsCRP水平，同時在光鏡下觀察大鼠頸動脈的形態(tài)學變化，探討牙周基礎(chǔ)治療輔以抗生素對As病變的影響，為臨床醫(yī)師治療伴有As的牙周病患者時選擇安全合理的治療方案提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇清潔級6周齡雄性SD大鼠35只進行實驗。大鼠體重180～200 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2009—0004。

1.1.2 主要實驗材料與試劑 維生素D3注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號：111111），阿莫西林膠囊（哈藥集團制藥總廠，批號：A111200318），甲硝唑片（亞寶藥業(yè)集團股份有限公司，批號：120105），鹽酸米諾環(huán)素軟膏（盛勢達國際貿(mào)易上海有限公司，批號：1111181）。大鼠血清hsCRP的ELISA試劑盒（上海藍基生物科技有限公司，hsCRP最低檢測質(zhì)量濃度為1.0 ng·mL-1）。

1.1.3 實驗用牙周致病菌 牙齦卟啉單胞菌標準菌株ATCC33277，由首都醫(yī)科大學口腔微生物研究室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 將牙齦卟啉單胞菌標準菌株置于CDC厭氧血瓊脂平板上培養(yǎng)，在85%N2、10%CO2和5%H2條件下培養(yǎng)3～5 d，再接種于CDC液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3 d，以達到最佳的菌細胞密度（約為1×108 CFU·mL-1）。接種前將菌液用培養(yǎng)液稀釋至1×106 CFU·mL-1以備用。

1.2.2 分組及建模 將35只SD大鼠適應性喂養(yǎng)2周后，隨機分為2個大組：正常對照組（A組，7只），采用正常飼料喂養(yǎng)；CP+As組（B組，28只），建立CP+As模型。建模方法：大鼠采用5%的水合氯醛腹腔注射麻醉，取仰臥位，固定四肢和頭部，以上頜第一、二磨牙（M1、M2）作為實驗牙，用3—0絲線纏繞于正畸結(jié)扎絲（直徑0.20 mm）上，將其8字結(jié)扎于實驗牙的牙頸部（盡量置于齦溝內(nèi)），而后將牙齦卟啉單胞菌的菌懸液接種于齦溝內(nèi)，每3天接種1次[9]。一次性腹腔注射維生素D3 7×105 IU·kg-1，2周內(nèi)逐漸增加高脂飼料[質(zhì)量分數(shù)分別為1.5%膽固醇+0.2%豬膽鹽+5%豬油（自制）+93.3%基礎(chǔ)飼料]直至完全替代普通飼料[10-11]。

B組根據(jù)模擬的臨床牙周干預治療再分為4小組，每組7只：自然進程（B1）組、牙周機械治療（B2）組、機械治療+局部藥物（B3）組和機械治療+局部藥物+抗生素（B4）組。

術(shù)后15周（從開始建模起），隨機檢查1只B1組大鼠，若發(fā)現(xiàn)左右上頜第一、二磨牙松動明顯且有深牙周袋，則處死該鼠進行血管病理切片檢查，若發(fā)現(xiàn)有脂質(zhì)沉積形成，認為CP+As建模成功，開始進行牙周干預。

1.2.3 牙周干預 B組牙周干預方法：B1組不給予任何牙周干預措施，任其自然發(fā)展；B2組進行牙周機械治療，包括齦上潔治+齦下刮治+根面平整術(shù)，每次治療1個象限的2顆患牙，共治療2次；B3組進行牙周機械治療（同B2組），同時給予局部藥物（鹽酸米諾環(huán)素軟膏）治療，每次治療1個象限的2顆患牙，共2次；B4組進行牙周機械治療、局部藥物治療（同B3組），同時給予抗生素全身治療。抗生素治療共干預2次，每次干預時采用灌胃法服用阿莫西林（200 mg·kg-1）和甲硝唑（100 mg·kg-1），每天1次，連續(xù)治療3 d。

1.2.4 牙周檢查 大鼠適應性喂養(yǎng)2周后開始進行牙周檢查，檢查每顆實驗牙的牙周袋深度（probing depth，PD）、齦溝出血指數(shù)（sulcus bleeding index，SBI）以及牙齒松動度（tooth mobility，TM）等。檢查時使用Williams牙周探針，由同一人每2周檢查1次。

1.2.5 血清hsCRP檢測 建模成功后，分別采集5次血清：干預前1周、第1次干預后1周、第2次干預后1周、第2次干預后3周、第2次干預后5周。采血前各組動物禁食12 h，尾靜脈采血1.5 mL。采用ELISA法檢測各組大鼠血清中hsCRP水平，嚴格按說明書操作。

1.2.6 動物處死、取材及處理 第5次采血完成后1周，全部動物進行安樂死。解剖大鼠，分離截取雙側(cè)頸總動脈及分叉段標本（長約1 cm），剝離頸動脈筋膜，無菌生理鹽水沖洗，用10%中性甲醛溶液固定48 h，常規(guī)石蠟包埋后，以5 μm的厚度行血管橫斷面切片，蘇木精-伊紅（hematine-eosin，HE）染色，顯微鏡下觀察各組大鼠頸總動脈血管壁的形態(tài)學變化。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，組間比較采用重復測量資料的方差分析，兩時間點比較采用Bonferroni法檢驗，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 牙周檢查情況

建模前，各組大鼠實驗牙牙齦色粉質(zhì)韌，無炎癥變化。建模成功后，A組上頜M1、M2未見炎癥改變。B組（B1、B2、B3、B4組）實驗牙均出現(xiàn)典型慢性牙周炎癥狀，牙頸部8字結(jié)扎處可見軟垢、食物殘渣，個別嚴重者可見牙石，牙齦紅腫，探診出血明顯，SBI=3，可探及1.5～2 mm的牙周袋，有牙齦退縮以及附著喪失，松動度達Ⅱ°。

2次牙周干預后5周， B1組牙齦紅腫明顯，牙齦退縮嚴重，SBI=4，有1.5～2 mm的牙周袋，松動度達Ⅱ°～Ⅲ°；B2組牙齦色粉質(zhì)韌，牙齦退縮有所改善，SBI為1～2，可探及1～1.5 mm的淺牙周袋，松動度Ⅰ°；B3、B4組牙齦色粉質(zhì)韌，牙齦退縮明顯改善，SBI=1，可探及0.5～1 mm的淺牙周袋，牙松動不明顯。

2.2 大鼠頸總動脈血管壁病理學改變

A組頸總動脈血管壁的厚度均一，內(nèi)膜完整，中膜平滑肌細胞（smooth muscle cell，SMC）和彈性纖維排列整齊，未見泡沫細胞（圖1A）；B1組血管壁明顯增厚，可見SMC遷移至內(nèi)膜并有炎癥細胞黏附，中膜SMC變性萎縮，形成大量泡沫細胞，彈性纖維明顯紊亂破壞（圖1B）；B2組血管壁厚薄不均，內(nèi)膜炎癥細胞黏附，中膜SMC變性萎縮，可見泡沫細胞廣泛分布，彈性纖維紊亂（圖1C）；B3組血管壁輕度增厚，可見炎癥細胞黏附于內(nèi)膜，中膜SMC空泡變性，彈性纖維排列較整齊（圖1D）；B4組血管壁厚度較均勻，內(nèi)膜可見炎癥細胞黏附，SMC變性，可見泡沫細胞形成，但彈性纖維排列整齊（圖1E）。

2.3 hsCRP表達水平

各組牙周干預前后hsCRP的變化見表1。在所有的取樣時間點，與A組相比，B組（除B3、B4組第5次取樣時間點外）hsCRP質(zhì)量濃度均明顯升高（P<

0.001）。B1組hsCRP質(zhì)量濃度隨著時間的變化逐漸升高，尤其是第5次取樣時明顯高于其他組（P<

0.001）；B2、B3、B4組hsCRP隨時間變化逐漸升高，在第2次干預后1周達到高峰，此后逐漸下降，低于其基線水平，但仍高于A組（P<0.05）。第2次干預后3周及5周，B3、B4組hsCRP質(zhì)量濃度明顯低于B2組，其差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。

3 討論

大量臨床流行病學和干預研究表明，牙周治療在短期內(nèi)可引起As一些中間替代指標（CRP、白細胞介素-6、內(nèi)膜和中膜厚度）升高，而長期則會使這些指標下降[4-5，12-13]，進而推測牙周治療可能會降低As發(fā)生的風險。Meta分析結(jié)果表明，對首次診斷為心肌梗死和出血性腦卒中的患者進行侵入性口腔治療，治療后的前4周內(nèi)血管事件的發(fā)生率會顯著升高，而其后的6個月則會降低并逐漸達到基線水平[14]。但是，這些臨床干預研究由于倫理學原因，只有中間替代指標的結(jié)果，缺乏終極結(jié)局指標血管的病理學支持。

目前相關(guān)的動物實驗研究[10-11]多數(shù)都是在建模成功后就立即處死動物，缺乏建模后各種口腔干預措施對As影響的研究。由于牙周病的主要治療多屬于有創(chuàng)治療且確實對各型牙周炎的控制都有很好的療效，那么這種口腔干預措施（有創(chuàng)治療）對As的發(fā)生發(fā)展有何影響？是改善還是加重？本課題組前期通過動物實驗[7-8]研究牙周干預的效果，結(jié)果表明，在高脂狀態(tài)下，直接的牙周機械治療后，在短期內(nèi)（第2次干預后1周左右）hsCRP的量急劇增加，且血管出現(xiàn)明顯的As病變，有纖維帽形成和斑塊破裂，提示直接進行牙周機械治療可能會加重As的病變且hsCRP可能參與了As加重的病變過程。這種改變僅僅是牙周機械治療后引起的短期改變還是永久改變？隨著時間的延長，血清中炎癥因子hsCRP的含量會否降低？血管的病理改變是否也會隨之改善？單純進行牙周機械治療可以引起明顯的血管病理改變，那么怎樣的治療方案才是合理安全的？局部及全身輔助用藥是否會改善炎癥狀態(tài)和血管的病理改變？為了解決這些問題，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，增加了大鼠的數(shù)量（每組7只均成活）并延長了4周的觀察期（從首次口腔干預開始到最后處死共觀察9周），增加了2次血清采樣時間的標本，并且在牙周機械處理的措施中，增加了局部和全身用藥。

本次研究結(jié)果顯示：2次牙周干預治療后，B組（CP+As）的hsCRP質(zhì)量濃度較正常對照組明顯升高，其中B1組隨著時間延長呈現(xiàn)持續(xù)升高，在最后1次采血時（第2次干預后5周左右）hsCRP含量明顯高于其他各組，同時病理切片顯示血管壁明顯增厚，可見SMC遷移至內(nèi)膜并有炎癥細胞黏附，中膜SMC變性萎縮，形成大量泡沫細胞，彈性纖維明顯紊亂破壞，提示牙周局部炎癥持續(xù)存在可能會加重As的病變程度。

CP+As組的其他各干預組隨時間改變hsCRP質(zhì)量濃度逐漸升高，在第2次干預后1周達到高峰，該結(jié)果與本課題組的前期研究結(jié)果[7-8]保持了部分一致，即在短期內(nèi)牙周干預措施可能引起全身水平的急性期反應，促使hsCRP水平迅速升高，但是隨著觀察時間進一步延長，hsCRP含量逐漸下降。這與Tonetti等[4]的臨床干預研究結(jié)果極為相似。

本研究對牙周基礎(chǔ)治療措施進行了更細致的劃分，除機械治療（潔治+刮治+根面平整）外，還增加了局部抗炎藥物和全身抗生素治療。局部抗炎藥使用的是臨床牙周病治療中的常用的局部藥物——鹽酸米諾環(huán)素軟膏（派麗奧），全身用藥主要是阿莫西林和甲硝唑，結(jié)果表明：在牙周局部機械治療的基礎(chǔ)上，輔助局部和全身用藥可以明顯降低血清hsCRP質(zhì)量濃度，且頸動脈血管的病理變化也較單純機械治療組及自然進程組減輕。

在CP+As建模成功后，對各組進行常規(guī)牙周檢查發(fā)現(xiàn)，B1～B4組均有1.5～2 mm的深牙周袋，符合派麗奧軟膏使用適應證。B3和B4組在2次牙周干預時，在牙周機械治療基礎(chǔ)上將該藥均勻注射至深牙周袋內(nèi)直至溢出齦緣，且術(shù)后2 h內(nèi)禁食禁水以更好地維持藥效。第2次牙周干預后5周，B3、B4組的PD、SBI和牙齒松動度均有明顯改善。從血清學結(jié)果看，與其他干預組相比，機械治療+局部藥物+抗生素組（B4組）在最后1次取樣時hsCRP質(zhì)量濃度最低，牙周局部炎癥反應改善最為明顯，且頸動脈病變最輕。單純機械治療組比其他輔助用藥的兩組hsCRP表達高，同時病理結(jié)果也顯示頸動脈有較明顯的As病理改變。該結(jié)果表明，局部抗炎、全身抗生素治療可以優(yōu)化單純牙周機械治療的效果，尤其是二者同時使用時療效最顯著，這提示，臨床上對于伴有As的牙周病患者，在單純牙周基礎(chǔ)治療的同時增加局部抗炎和全身抗生素應用，可能會更加有效地降低As的病變及風險，值得臨床借鑒。

[參考文獻]

[1] Desvarieux M， Demmer RT， Rundek T， et al. Relationship between periodontal disease， tooth loss， and carotid artery plaque： the Oral Infections and Vascular Disease Epide-miology Study（INVEST）[J]. Stroke， 2003， 34（9）：2120-

2125.

[2] Devaraj S， Singh U， Jialal I. The evolving role of C-reac-tive protein in atherothrombosis[J]. Clin Chem， 2009， 55

（2）：229-238.

[3] Kuvin JT， Kimmelstiel CD. Infectious causes of atheros-clerosis[J]. Am Heart J， 1999， 137（2）：216-226.

[4] Tonetti MS， DAiuto F， Nibali L， et al. Treatment of pe-riodontitis and endothelial function[J]. N Engl J Med， 2007， 356（9）：911-920.

[5] Minassian C， DAiuto F， Hingorani AD， et al. Invasive den-tal treatment and risk for vascular events： a self-controlled case series[J]. Ann Intern Med， 2010， 153（8）：499-506.

[6] 任秀云， 石學雪， 孫麗莉， 等. 口腔干預對牙周炎大鼠動脈粥樣硬化影響的研究[J]. 北京口腔醫(yī)學， 2012， 20（5）：

241-245.

Ren Xiuyun， Shi Xuexue， Sun Lili， et al. Influence of oral interventions on atherosclerosis in SD rats with periodon-titis[J]. Beijing J Stomatol， 2012， 20（5）：241-245.

[7] 孫麗莉， 石學雪， 任秀云， 等. 牙周干預措施對動脈粥樣硬化影響的實驗動物研究[J]. 中華口腔醫(yī)學研究雜志：電子版， 2012， 6（3）：257-265.

Sun Lili， Shi Xuexue， Ren Xiuyun， et al. Influence of pe-riodontal interventions on atherosclerosis in animals[J]. Chin

J Stomatol Res： Electronic Edition， 2012， 6（3）：257-265.

[8] 石學雪， 孫麗莉， 任秀云， 等. 牙周基礎(chǔ)治療對伴或不伴高脂血癥的慢性牙周炎大鼠動脈粥樣硬化發(fā)生的影響研究[J]. 中國實用口腔科雜志， 2012， 5（6）：346-349.

Shi Xuexue， Sun Lili， Ren Xiuyun， et al. Effects of perio-dontal basic therapy on atherosclerosis in chronic periodon-titis rats with or without hyperlipidemia[J]. Chin J Pract Stomatol， 2012， 5（6）：346-349.

[9] Di Paola R， Marzocco S， Mazzon E， et al. Effect of amino-guanidine in ligature-induced periodontitis in rats[J]. J Dent Res， 2004， 83（4）：343-348.

[10] 丁鰲， 王曉燕， 唐昊喆， 等. 小型豬牙周感染與動脈粥樣硬化復合模型的建立[J]. 牙體牙髓牙周病學雜志， 2008， 18（4）：190-194.

Ding Ao， Wang Xiaoyan， Tang Haozhe， et al. Establishment of periodontal infection and atherosclerosis compound mo-del in minipig[J]. Chin J Conserv Dent， 2008， 18（4）：190-

194.

[11] 倪佳， 張源明， 徐雋， 等. 炎癥因子在大鼠慢性牙周炎合并動脈粥樣硬化模型中的表達[J]. 牙體牙髓牙周病學雜志， 2009， 19（3）：136-140.

Ni Jia， Zhang Yuanming， Xu Jun， et al. Expression of in-flammatory cytokines in the model of chronic periodontitis associated with atherosclerosis of rats[J]. Chin J Conserv Dent， 2009， 19（3）：136-140.

[12] 張衛(wèi)東. 牙周病與冠心病的相關(guān)性研究[J]. 國外醫(yī)學口腔醫(yī)學分冊， 2002， 29（4）：241-243.

Zhang Weidong. Periodontal diseases and coronary heart diseases[J]. Foreign Medical Sciences（Stomatology）， 2002， 29（4）：241-243.

[13] Iwamoto Y， Nishimura F， Soga Y， et al. Antimicrobial periodontal treatment decreases serum C-reactive protein， tumor necrosis factor-alpha， but not adiponectin levels in patients with chronic periodontitis[J]. J Periodontol， 2003， 74（8）：1231-1236.

[14] Wu T， Trevisan M， Genco RJ， et al. Periodontal disease and risk of cerebrovascular disease： the first national health and nutrition examination survey and its follow-up study[J]. Arch Intern Med， 2000， 160（18）：2749-2755.

（本文編輯 吳愛華）