腦梗死患者血漿硫化氫、胱硫醚－β－合酶含量變化及意義

鄭永強 葉 飛 劉南暖 鄧曉玲 徐 悅 周發(fā)明

腦梗死是由于供應腦組織的動脈發(fā)生病變所導致的疾病，常伴偏癱、失語、偏盲、意識障礙甚至死亡。內(nèi)源性H2S是機體內(nèi)重要的氣體信號分子，主要是由胱硫醚－β－合酶、胱硫醚－γ－裂解酶和半胱氨酰轉移酶催化L－半胱氨酸生成，其中CBS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生H2S的酶［1］。本研究旨在探討腦梗死患者與健康對照組中H2S、CBS水平的差異，腦梗死不同梗死面積及相關危險因素對內(nèi)源性H2S、CBS分泌的影響，以探討內(nèi)源性H2S、CBS在腦梗死發(fā)病中可能的病理生理機制。

1．材料與方法

1.1 材料 選擇在我院2012年6月～12月神經(jīng)內(nèi)科住院的腦梗死患者167例，男性85例，女性82例，平均年齡60.1±9.3歲。所有患者均經(jīng)頭顱CT和(或)MRI檢查確診，符合1995年全國第四屆腦血管病會議制定的診斷標準。所有腦梗死患者中，合并高血壓55例，糖尿病28例。腦梗死組再根據(jù)梗死體積按Pu llicino公式［2］計算分為:大面積梗死(梗死灶＞10cm3)29例，中面積梗死(5～10cm3)43例，小面積梗死(＜5cm3)95例(其中87例腔隙性腦梗死患者)。排除標準:患者入院前曾服用影響硫化氫和胱硫醚－β－合酶代謝的藥物，如抗癲癇藥、鎮(zhèn)靜催眠藥、抗膽堿藥、服用維生素B1、B6、B12、葉酸及接受干擾素治療者;心源性腦栓塞、肺肝腎功能異常、癲癇、甲狀腺疾病、銀屑病、腫瘤、惡性貧血、內(nèi)分泌功能失調(diào)等重大疾病者。

對照組為108例同期我院門診健康體檢者，男性54例，女性54例，平均年齡60.1±9.1歲，既往無心腦血管疾病和糖尿病病史，無甲狀腺、肝腎功能明顯減退及代謝性疾患，性別、年齡構成與腦梗死組無統(tǒng)計學差異。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準，所有研究對象均獲知情同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑及儀器:全自動酶標儀BIO-TEK ELX800(美國寶特公司)，低溫高速離心機;CBS檢測試劑盒和考馬斯亮蘭蛋白檢測試劑盒由武漢博士德公司提供。

1.2.2 標本采集:所有患者于入院后第二天清晨空腹用真空采血管采血5ml(肝素抗凝)，以3000r/min離心10分鐘，分離血清，置于 －70℃冰箱保存，用于測定血漿 H2S、CBS含量。

1.2.3 血漿H2S水平的測定:采用分光光度法測定血漿H2S［3］。在試管中加入1%醋酸鋅0.25ml然后加入0.1ml血漿，使血漿中的硫離子與醋酸鋅充分結合形成醋酸鋅膠體，再加入20mmol/L對苯二胺鹽酸鹽、7.2mmol/L鹽酸250μl和30mmol/L三氯化鐵、1.2mmol/L鹽酸250μl室溫孵育20分鐘，使之充分顯色，加入10%三氯醋酸0.5ml使蛋白沉淀，離心(6000r/min)5分鐘，吸取上清液，用全自動酶標儀在波長665nm處檢測吸光度。根據(jù)NaHS標準曲線計算血漿中硫化氫的含量，結果以μmol/L為單位。

1.2.4 血漿CBS水平的測定:檢測前做標準曲線，使樣品符合試劑盒的檢測范圍，加樣板分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，將樣品加于酶標板孔底部，37℃反應120分鐘，依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色，依次加入反應液及終止液，加入終止液后立即檢測450nm波長處各孔的光密度(OD值)，應用考馬斯亮蘭蛋白檢測試劑盒檢測樣品蛋白含量，依據(jù)公式計算CBS活性，以上操作嚴格按照說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，指標檢測結果用(±s)表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2．1 腦梗死患者血漿H2S、CBS含量均明顯低于健康對照組(P ＜0.01，見表1)。

表1 腦血管病各組患者與健康對照組血漿H2S、CBS 比較(±s)

表1 腦血管病各組患者與健康對照組血漿H2S、CBS 比較(±s)

注:*表示P＜0.01與對照組比較。

組別 例數(shù)年齡 H2S CBS對照組 108 60.1±9.1 50.1±3.4 39.0±3.0 CI 167 60.1±9.3 25.8±9.2* 4.1±3.8*

2．2 在167例腦梗死患者中，大面積腦梗死患者H2S含量明顯高于中面積和腔隙性腦梗死患者(P＜0.01)，CBS含量顯著低于腔隙性腦梗死患者(P＜0.01)，而與中面積腦梗死患者無顯著性差異(P＞0.05)，無統(tǒng)計學意義。

表2 腦梗死患者血漿H2S、CBS比較(±s)

表2 腦梗死患者血漿H2S、CBS比較(±s)

注:*表示P＜0.01，與中面積和腔隙性腦梗死患者比較。

組別年齡 例數(shù) H2S CBS大面積 60.7±8.3 29 38.2±9.5* 1.8±0.1*中面積 61.5±8.2 43 18.8±2.8 2.2±0.3小面積59.3±8.3 95 25.2±5.9 5.7±1.5

3.討論

腦梗死主要是由于大腦血液供應不足引起的一種常見的急性或慢性腦血管疾病，缺血引起的神經(jīng)細胞不可逆的損傷，從而導致腦功能的降低或損壞。如果能在疾病進展早期對神經(jīng)元進行保護，從蛋白分子基礎上調(diào)控缺血的病理生理過程，盡快阻止或消除有害的因素，將可以最大限度爭取為腦缺血的救助爭取時間，延緩或減輕不可逆神經(jīng)系統(tǒng)損傷的進展。腦缺血后，機體也會作出反應，主動地產(chǎn)生神經(jīng)保護作用的相關因子，這種機體內(nèi)在的對抗機制使機體能耐受一定程度的缺血損傷。如事先短暫的缺血或預適應可動員機體內(nèi)在的防護能力，從而對隨后的嚴重缺血產(chǎn)生保護作用［4］。本研究主要是通過研究腦梗死患者的內(nèi)源性硫化氫所起的可能作用及其機制，為預防和治療腦梗死患者提供新的藥物研究方向。

內(nèi)源性硫化氫是由同型半胱氨酸代謝產(chǎn)物之一的半胱氨酸在胱硫醚β－合酶、胱硫醚－γ－裂解酶或半胱氨酸轉移酶的催化下產(chǎn)生的。腦內(nèi)產(chǎn)生硫化氫的主要酶是胱硫醚β－合酶。已有眾多研究表明硫化氫和高同型半胱氨酸之間可能存在內(nèi)源性的相互調(diào)節(jié)作用。

在腦梗死患者中硫化氫和胱硫醚－β－合酶減少可能與在腦缺血再灌注過程中一氧化氮大量生成，一氧化氮可結合到胱硫醚－β－合酶的亞鐵血紅素部分時，會抑制酶的活性，從而使硫化氫和胱硫醚－β－合酶生成減少。有研究證實:揭示在腦組織缺氧缺血狀態(tài)下，出現(xiàn)內(nèi)源性胱硫醚－β－合酶/硫化氫體系活化，以及胱硫醚－β－合酶/硫化氫體系通過上調(diào)bcl-2表達，拮抗缺氧缺血所致腦組織損傷，減少細胞凋亡的作用機制［5］。而大面積腦梗死患者中，胱硫醚－β－合酶減少考慮與腦組織大量壞死，包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞破壞，從而導致腦組織硫化氫的生成減少，而實際上我們檢測的硫化氫生成增多，考慮可能與機體應激導致，外周硫化氫生成明顯升高有關。目前有研究表明，在危重病患者中，隨血清硫化氫濃度水平增高，危重病患者病死率也隨之增高［6］。顱腦外傷大鼠急性期血清硫化氫血清內(nèi)源性硫化氫的含量隨損傷程度加重而濃度升高［7］?？赡芘c硫化氫具有抗氧化應激的作用，能升高細胞內(nèi)谷胱甘肽水平，以一種劑量依賴型的方式保護神經(jīng)細胞免受谷氨酸的氧化毒性作用，是一種內(nèi)源性過氧化亞硝酸鹽清道夫，發(fā)揮著抗自由基的作用，但過高的硫化氫導致機體中毒而危及生命，在大面積腦梗死病例中有14例死亡，硫化氫濃度均偏高，但其機制有待進一步的研究。

綜上所述，血漿中硫化氫、胱硫醚－β－合酶含量的變化可能參與腦梗死的發(fā)病機制，因此選擇作用于H2S、CBS靶點生成的藥物，為臨床藥物研制提供一個新的方向。

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