高富硒酵母菌誘變選育研究

曾禮華， 馬平美， 李 維*， 黃崇波， 張 純，陳貴英， 葛方蘭， 唐 凌， 鄺聲耀

（1.四川師范大學 生命科學學院，四川 成都610061；2.四川省畜科飼料有限公司，四川 成都610066）

世界衛(wèi)生組織于1973年將硒確定為人和動物必需的微量元素，同年美國FDA批準亞硒酸鈉和硒酸鈉可作為飼料添加劑應用于動物養(yǎng)殖業(yè)。近年來，越來越多的研究揭示和驗證了硒的多種生理功能，主要包括：抗氧化作用[1-2]，增強免疫作用與抗病作用[3-5]，調(diào)節(jié)機體代謝[2]，另外，硒還能增強人和動物的生殖機能[6-7]，具有抗自由基，延緩衰老，拮抗有毒元素等作用[7]。

由于硒元素具有上述重要的生理功能，其作為機體必需的營養(yǎng)元素早就引起人們的高度重視[8-9]。目前，硒營養(yǎng)強化劑主要有3種即無機態(tài)亞硒酸鈉、有機態(tài)硒及富硒酵母，無機硒和有機硒化合物都能被動物機體吸收，但是，由于畜禽對無機硒吸收利用過程中，無機硒須先進入肝臟，轉(zhuǎn)化成生物硒后才可被吸收，因而毒性很大，而富硒酵母具有吸收性好、安全無毒等優(yōu)點，是一種比較理想的硒營養(yǎng)劑[9]，已被用作營養(yǎng)強化劑應用到各種食品中，在預防和治療疾病以及養(yǎng)殖業(yè)等方面也有廣泛的應用[8-9]。我國20個省市中，缺硒、貧硒縣高達72%，全國近7億人口處于缺硒狀態(tài)，因此開發(fā)高富硒酵母具有重要的意義。

酵母硒是通過酵母自身的代謝活動，將無機硒在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為與蛋白質(zhì)和多糖相結(jié)合的有機硒，提高了硒的利用率和安全性[10]。已有的研究結(jié)果表明，在酵母體內(nèi)硒主要以硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸形式存在[9-10]。硒是硫的類似物，硒被生物同化吸收是利用S的代謝酶作用進入細胞，取代S整合到游離氨基酸和蛋白質(zhì)中[9-10]，因而，無機硒鹽離子和無機硫酸酸根離子在吸收同化過程中競爭同一轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。

國內(nèi)已有多篇有關富硒酵母菌選育的報道[11-13]，但多采用單一誘變劑處理的方法，難以獲得理想的富硒酵母突變菌株。作者利用多種來源的酵母菌，先通過亞硒酸抗性篩選，選出硒耐受性和富硒能力強的酵母菌株，并以此為出發(fā)菌株，經(jīng)亞硝基胍（NTG）、紫外線復合誘變，再分別結(jié)合亞硒酸抗性、乙硫氨酸抗性篩選，選育出高產(chǎn)富硒酵母菌株，旨在為酵母硒的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

由市農(nóng)產(chǎn)品市場購買到的8種食用酵母粉和3種酒曲，作為菌株分離的樣品來源。另外，從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買到10株食品安全級的酵母菌直接作為供試菌株，包括：2株熱帶假絲酵 母 （Candida tropicalis），2 株 釀 酒 酵 母（Saccharomyces cerevisiae），2 株 產(chǎn) 朊 假 絲 酵 母（Candida utilis）， 其余葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum）、異常漢遜酵母（Hansenula anomala）、白球擬 酵 母 （Torulopsis candida）、 粟 酒 裂 殖 酵 母（Schizosaccharomyces pombe）各 1 株。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 YEPD和YNB培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的配制參照文獻[14-15]的方法，加1.8%的瓊脂即成固體培養(yǎng)基；

1.2.2 酵母菌分離培養(yǎng)基 （孟加拉紅培養(yǎng)基）配方 （g/L）：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀（K2HPO4·3H2O）1 g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，氯霉素 0.1 g；上述各成分加入蒸餾水中溶解后，再加孟加拉紅溶液（1%水溶液）3.3 mL。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培養(yǎng)基中，分裝后，121℃滅菌20 min；

1.2.3 亞硒酸鈉抗性篩選培養(yǎng)基 在YEPD培養(yǎng)基中加入一定濃度過濾滅菌的亞硒酸鈉溶液；

1.2.4 乙硫氨酸抗性培養(yǎng)基 在YNB培養(yǎng)集中加入一定量過濾滅菌的乙硫氨酸溶液。

1.3 試劑

3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）：Fluka 公司產(chǎn)品；亞硝基胍、DL-乙硫氨酸、硒代蛋氨酸標準品：Sigma公司產(chǎn)品。

1.4 菌種初篩

分別稱取食用酵母粉和酒曲樣品各2 g，加入到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基中，30℃，靜置活化2 h，梯度稀釋，取0.2 mL稀釋涂布于酵母菌分離培養(yǎng)基上，30℃，培養(yǎng)24 h，挑取單菌落于斜面保存。

1.5 亞硒酸鈉抗性復篩

亞硒酸鈉溶液過濾除菌后，加入到滅菌的培養(yǎng)基中， 制備 Se4+含量分別為 0、10、20、40、60、80、100、120 μg/mL的亞硒酸鈉抗性培養(yǎng)基。將分離獲得的酵母菌株及購買的10株菌活化后，制作菌懸液，分別取0.2 mL菌懸液，涂布于上述固體亞硒酸鈉抗性培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)，48 h后觀察。選出菌落較大，顏色較淺的酵母菌于斜面培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)。從新鮮斜面上轉(zhuǎn)接于一環(huán)菌體于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，測其生物量和硒含量，篩選出生物量和硒含量較高的酵母菌株。

1.6 酵母中硒含量的測定

參照文獻[14-16]，采用 3，3’-二氨基聯(lián)苯胺比色法測定酵母細胞的總硒含量及無機硒含量，兩者之差即為酵母細胞內(nèi)有機硒的含量。

1.7 菌體生物量的測定

取發(fā)酵菌液于4 000 r/min離心10 min，收集菌體，無菌水洗滌3次，65℃烘干至恒重后，稱量即得菌體生物量（g/L）。

1.8 氨基酸成分分析

樣品的氨基酸成分委托中國測試技術(shù)研究院測定。

1.9 菌種的誘變與篩選

1.9.1 亞硝基胍誘變及亞硒酸鈉抗性篩選 取生長至對數(shù)期的酵母菌懸液，4 000 r/min離心，用生理鹽水洗滌數(shù)次，懸浮于檸檬酸緩沖液，細胞濃度調(diào)至107個/mL，加入0.5 mL亞硝基胍溶液，35℃振蕩處理1 h，其致死率為80%。加入生理鹽水稀釋終止反應，再用生理鹽水洗滌數(shù)次，懸浮于生理鹽水中。取適量上述菌液涂布于Se4+含量為80 μg/mL的亞硒酸鈉抗性平板中，避光培養(yǎng)48 h。

1.9.2 紫外線誘變及乙硫氨酸抗性篩選 取生長至對數(shù)期的酵母菌懸液稀釋，涂布于乙硫氨酸質(zhì)量濃度分別為 0.5、1、1.5、2、2.5、3 g/L 的 YNB 培養(yǎng)基上（每一個濃度梯度設2個平行實驗組），經(jīng)48～72 h培養(yǎng)后，確定菌株的乙硫氨酸敏感性。

將前述誘變獲得的高產(chǎn)菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，收集細胞，用無菌水稀釋成107個/mL。吸取6 mL菌懸液于直徑為9 cm的無菌平板中，將平皿置于紫外誘變箱中，使無菌平板距離紫外燈管25 cm左右，經(jīng)紫外燈照射60 s，致死率為80%。將經(jīng)上述紫外線誘變處理后的菌液適當稀釋，涂布于乙硫氨酸抗性平板上，避光培養(yǎng)48 h。

2 結(jié)果與討論

2.1 亞硒酸鈉抗性菌株篩選

從8種食用酵母粉和3種酒曲中分離獲得26株菌株，加上作者所在實驗室購買并保存的10株酵母菌，共計36株。對該36株酵母菌進行亞硒酸鈉抗性篩選，獲得3株能在Se4+質(zhì)量濃度為80 μg/mL的平板上生長的菌株。研究表明，在Se4+質(zhì)量濃度低于20 μg/mL的平板上，各個菌株與對照組相比，生長狀況無明顯差異。Se4+質(zhì)量濃度大于20 μg/mL時，有的菌株生長開始受阻；當Se4+質(zhì)量濃度達到40 μg/mL時，有14株能正常生長；當Se4+質(zhì)量濃度達到80 μg/mL時，不同酵母菌株生長差異十分明顯，36株供試菌中僅有3株能正常生長，它們分別是釀酒酵母A1-2，熱帶假絲酵母1254，產(chǎn)朊假絲酵母Y-3，當 Se4+質(zhì)量濃度高達 100 μg/mL時，所有菌株均不能正常生長。對該3株菌株分別進行復篩，測定其生物量、總硒質(zhì)量分數(shù)、無機硒質(zhì)量分數(shù)，計算有機硒質(zhì)量分數(shù)及轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見表1。

表1 亞硒酸鈉抗性菌株的篩選Table 1 Screening of sodium selenite-resistant strains

由表 可見，熱帶假絲酵母菌株 的生物量、有機硒含量及有機硒轉(zhuǎn)化率均最高，分別為4.1 g/L、521.99 μg/g、73.26%。故選擇熱帶假絲酵母菌株1254作為誘變育種的出發(fā)菌株。

2.2 亞硝基胍誘變及亞硒酸鈉抗性株的篩選

出發(fā)菌株熱帶假絲酵母菌1254經(jīng)亞硝基胍誘變后，涂布亞硒酸鈉抗性平板篩選，以菌落大小和顏色特征為指標，挑出菌落較大顏色較淺的株菌，依次編號。將各菌株接種在 Se4+質(zhì)量濃度為80 μg/mL的液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定菌株的生物量、總硒量、無機硒質(zhì)量分數(shù)，計算有機硒的質(zhì)量分數(shù)及轉(zhuǎn)化率。共計挑出12株菌落較大、顏色較淺的菌株，進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率均最高的菌株1254-6，與出發(fā)菌株對比如表2。

表2 出發(fā)菌株1254和化學誘變株1254-6的生物量及硒質(zhì)量分數(shù)Table 2 Biomass and selenium content of the parental strain 1254 and mutant 1254-6

由表2可見，與出發(fā)菌株1254相比，誘變菌株1254-6的生物量降低了13.17%，但誘變菌株1254-6的總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率分別是出發(fā)菌株1254的6.59倍、7.72倍、1.17倍，故選取菌株1254-6作為下一輪誘變育種的材料。

2.3 紫外線誘變及乙硫氨酸抗性菌株篩選結(jié)果

2.3.1 乙硫氨酸抗性分析 將菌株1254-6活化后稀釋，涂布于一定乙硫氨酸濃度梯度的YNB培養(yǎng)基上，經(jīng)48～72 h培養(yǎng)后，觀察其生長情況。結(jié)果顯示，與大多數(shù)酵母菌相似，該菌株在乙硫氨酸質(zhì)量濃度為1.0 g/L的平板上，不能正常生長。因此選擇乙硫氨酸質(zhì)量濃度為1.0 g/L作為誘變抗性的篩選質(zhì)量濃度。

2.3.2 乙硫氨酸抗性株的篩選 1254-6菌株經(jīng)紫外誘變處理，菌懸液稀釋涂布于含1.0 g/L乙硫氨酸的YNB平板上，避光培養(yǎng)72 h。挑選生長快，菌落較大，顏色較淺的抗性菌株共37株，編號為1254-6-1到1254-6-37。將其點樣于含乙硫氨酸的平板上，培養(yǎng)48～72 h，每組設3個平行實驗組。根據(jù)菌落大小及生長情況選取16株菌株，在發(fā)酵培養(yǎng)集中進行富硒培養(yǎng)，測定菌株的生物量、總硒量、無機硒質(zhì)量分數(shù)，計算有機硒質(zhì)量分數(shù)及轉(zhuǎn)化率。其中菌株1254-6-1含硒量最高的，結(jié)果如表3所示。

表3 菌株1254-6-1生物量及硒質(zhì)量分數(shù)Table 3 Biomass and selenium content of mutant 1254-6-1

由表3可見，與菌株1254-6相比，菌株1254-6-1的生物量、總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率分別提高了2.13倍、1.20倍、1.21倍、1.01倍。與原始出發(fā)菌株1254相比，雙抗菌株1254-6-1的生物量、總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及轉(zhuǎn)化率分別提高1.85倍、7.90倍、9.35倍、1.18倍，分別達到 7.60 g/L、5 626.00 μg/g、4 879.99 μg/g、86.74%。

出發(fā)菌株1254經(jīng)亞硝基胍誘變處理，顯著提高了菌株總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率，但降低了菌株生物量。出發(fā)菌株1254經(jīng)亞硝基胍誘變處理后，再采用紫外線誘變處理，結(jié)果獲得的菌株生物量得以明顯提高，總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率也得以改善。由此可見，采用不同誘變劑處理，可以減少單一誘變劑的負突變，實現(xiàn)正突變的累加，從而提高育種效率。

2.4 突變菌株氨基酸含量分析

利用氨基酸自動分析儀對雙抗性株1254-6-1與出發(fā)株1254氨基酸的質(zhì)量分數(shù)進行測定，結(jié)果見表4。

表4 誘變株1254-6-1與出發(fā)株1254氨基酸質(zhì)量分數(shù)Table 4 Content of amino acids of mutant 1254-6-1 and the parental strain 1254

由表4可知，經(jīng)過連續(xù)誘變及兩種抗性平板的反復篩選得到的菌株1254-6-1，各種氨基酸的相對質(zhì)量分數(shù)均高于出發(fā)菌株，其中蛋氨酸是出發(fā)株的135%，胱氨酸是194.1%，從代謝途徑來可知，胱氨酸為蛋氨酸的合成提供巰基，說明合成前體物含量的增加可造成蛋氨酸的增加。有前人研究結(jié)果可知，在酵母體內(nèi)硒主要以硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸形式存在[8-9]，因此由此推測，半胱氨酸和蛋氨酸含量的變化與酵母體內(nèi)硒含量是呈正相關性的。此外，與出發(fā)菌株相比，誘變后菌株中酪氨酸的含量也有較大提高，是出發(fā)菌株的140%。酪氨酸用途很廣泛，在醫(yī)藥上用作甲狀腺功能亢進，也可作為食品添加劑。另外酪氨酸還是一種重要的生化試劑，是合成多肽類激素、抗生素、L-多巴等藥物的主要原料。廣泛用于農(nóng)業(yè)科學研究，也作飼料添加劑和配制人工昆蟲飼料。

3 結(jié)語

從8種食用酵母粉和3種酒曲中分離得到26株酵母菌菌株，連同由中國微生物菌種保藏中心提供的10株酵母菌，共36株菌。通過對該36株酵母菌進行硒耐受性初篩和搖瓶發(fā)酵富硒復篩，獲得1株硒耐受性高且富硒能力較強的熱帶假絲酵母菌株1254。對菌株1254進行了多輪誘變選育。通過亞硝基胍誘變，亞硒酸鈉抗性篩選后，獲得了12株抗性菌，其中突變菌株1254-6的總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率分別是出發(fā)菌株1254的6.59倍、7.72倍、1.17倍。突變菌株1254-6經(jīng)紫外誘變和乙硫氨酸抗性篩選后，獲得了乙硫氨酸抗性菌株37株，其中突變菌株1254-6-1的生物量、總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及轉(zhuǎn)化率分別達到7.60 g/L、5 626.00 μg/g、4 879.99 μg/g、86.74%。 對雙抗性株1254-6-1與出發(fā)株1254氨基酸的相對質(zhì)量分數(shù)分別進行測定，結(jié)果顯示，雙抗性株1254-6-1的各種氨基酸含量均高于出發(fā)菌株1254，其中蛋氨酸是出發(fā)株的135%，胱氨酸是194.1%。

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