適用于黃酒生物酸化浸米的乳酸菌篩選

程 斐 ， 周高峰 ， 謝廣發(fā) ， 陸 健 ， 曹 鈺 *

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；3.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江 紹興 312000；4.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝及技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122）

黃酒具有6 000多年的釀造歷史，它含有21種氨基酸和多種維生素成份以及許多種人體必需的微量元素，是一種具有很高營養(yǎng)價值的低酒精度飲料酒[1]。在黃酒釀造中，浸米是一個重要環(huán)節(jié)，它不僅能使原料大米充分吸水膨脹便于蒸煮，更可以使米酸化，以調(diào)節(jié)發(fā)酵醪液的酸度，保障發(fā)酵的安全進(jìn)行。傳統(tǒng)黃酒釀造，浸米時間長，如傳統(tǒng)攤飯法釀酒，浸米時間長達(dá)16～20 d。在機(jī)械化黃酒生產(chǎn)工藝中采用較高溫度條件保溫浸漬，浸米時間縮短，但仍然需要4～5 d[2]。浸米過程不當(dāng)是引起黃酒發(fā)酵醪酸敗的主要原因之一。而浸米的質(zhì)量隨米質(zhì)、浸米環(huán)境等波動較大，這就導(dǎo)致了浸米環(huán)節(jié)的穩(wěn)定性較差[3]。目前對于黃酒生產(chǎn)中浸米環(huán)節(jié)的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于其他釀造環(huán)節(jié)，主要集中于浸米水中微生物的認(rèn)識，浸米控制經(jīng)驗的總結(jié)以及不同品種米浸米特性的研究[4-7]。

生物胺是生物體內(nèi)產(chǎn)生的一類低相對分子質(zhì)量含氮有機(jī)化合物的總稱。過量外源生物胺的攝入會引起血管、動脈和微血管的擴(kuò)大，導(dǎo)致生物體的不良反應(yīng)。酒生產(chǎn)過程中，乳酸菌分泌的氨基酸脫羧酶作用于氨基酸會產(chǎn)生生物胺[8]。而使用既無氨基酸脫羧酶活性，又能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的生產(chǎn)菌株，能達(dá)到控制生物胺含量的目的[9-10]。

作者采用乳酸菌的快速篩選方法，從黃酒釀造環(huán)節(jié)的樣品中分離篩選出能在浸米水中快速產(chǎn)酸，具有較廣的抑菌作用，且生物胺反應(yīng)陰性的菌株，來實現(xiàn)生物酸化浸米，快速提高米漿水的酸度，縮短浸米時間，并抑制雜菌的生長，提高浸米過程的穩(wěn)定性，且有效的降低米漿水中生物胺含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 糯米：購于無錫小三里橋糧油市場；浸米水：紹興古越龍山酒廠機(jī)械化釀造工藝和傳統(tǒng)釀造工藝不同浸米時間的浸米水樣品；酒藥和酒曲：古越龍山酒廠提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基[11]，高錳酸鉀-溴化鉀平板[12]，生物胺菌株活化培養(yǎng)基，液體脫羧酶培養(yǎng)基[13]。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離 取不同來源的糯米，以料液比 1 kg∶1.5 L 于 30 ℃浸漬 24、48、72 h。 通過稀釋分離培養(yǎng)的方法，涂布于MRS平板上，30℃恒溫厭氧培養(yǎng)36 h，覆蓋上KMnO4-KBr瓊脂，30℃放置6 h，選取透明圈直徑與菌落直徑比較大的菌落[12]，進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶反應(yīng)和葡萄糖產(chǎn)氣實驗[11]，選取革蘭氏陽性，接觸酶反應(yīng)陰性，葡萄糖產(chǎn)氣陰性的菌株進(jìn)行保藏，進(jìn)行下步實驗。

古越龍山酒廠取樣浸米水，按上述步驟分離。

取酒藥和酒曲于添加有20 mg/L制霉菌素的MRS液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)后，按上述步驟分離。

1.2.2 生長和產(chǎn)酸實驗 菌株以5%的接種量接入液體MRS培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，測培養(yǎng)24 h時的pH值、總酸和A600nm，每株菌3個平行。

1.2.3 浸米水產(chǎn)酸實驗 種子液的制備：將活化的乳酸菌以5%的接種量接入MRS培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)16 h，8 000 r/min離心10 min，棄上清，加入無菌水重懸菌種；浸米：取糯米于250 mL錐形瓶中，以料液比1 kg∶1.5 L加入水，以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接入乳酸菌種子液，28℃培養(yǎng)48 h，過濾后測量浸米水的pH值和總酸，每株菌3個平行。

1.2.4 乳酸菌的抑菌實驗[14-15]乳酸菌發(fā)酵液的制備：將活化的乳酸菌接入加有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%CaCO3的MRS培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液以10 000 r/min離心10 min，取上清。

指示菌菌懸液制備：接種大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌于LB液體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。用無菌水稀釋成105個/mL菌懸液，4℃保存待用。

抑菌試驗：取指示菌菌懸液涂布于LB平板上，放置牛津杯于平板上，在牛津杯里加入200 μL菌株發(fā)酵液，置于4℃冰箱中12 h，37℃靜置培養(yǎng)16 h，觀察抑菌圈的大小。

1.2.5 乳酸菌產(chǎn)生物胺能力實驗 將菌株在菌株活化培養(yǎng)基中活化4次。然后接種于液體脫羧酶培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)4 d后，觀察顏色變化。做3組平行，以空白培養(yǎng)基對照。

1.2.6 16S rRNA分子生物學(xué)鑒定 提取DNA后，進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增[16]，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。由上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。根據(jù)測序所得的16S rRNA全序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對后，選取GenBank中同源乳酸菌菌株序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.7 菌株生理特性研究 活化后的菌種以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入液體MRS培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，每隔3 h取樣，測定pH值、總酸和A600nm，繪制產(chǎn)酸曲線和生長曲線，每組3個平行。

1.2.8 生物酸化浸米 取糯米于錐形瓶中，以料液比1 kg∶1.5 L加入水，以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接入乳酸菌種子液 （與不接種的進(jìn)行對照），28℃培養(yǎng)48 h，觀察浸米的品質(zhì)和浸米水的狀態(tài)。過濾，取浸米水，測pH值和總酸以及生物胺含量[17-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離

MRS平板上覆蓋KMnO4-KBr瓊脂后，選取（D透明圈/D菌落）數(shù)值大的菌株，純化后得到160株乳酸菌疑似菌株。其中革蘭氏陽性，接觸酶反應(yīng)陰性，葡萄糖產(chǎn)氣陰性的菌株78株。

2.2 生長和產(chǎn)酸實驗

測上述78株菌30℃培養(yǎng)24 h后的pH值、總酸以及A600nm值，選取酸度在18 g/L以上，A600nm值5.0以上，pH值低于3.5的菌株，共得到10株菌。

2.3 浸米水產(chǎn)酸實驗

將10株菌進(jìn)行生物酸化浸米實驗，測浸米48 h的pH和總酸，結(jié)果見圖1。

比較接種10株菌浸米48 h后浸米水的pH值和酸度，pH值均在3.4左右，差異性很小。酸度達(dá)到10 g/L 的有 B131、B94、B99、B142、B125、B101。

2.4 抑菌試驗

采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法做抑菌試驗，測量不同受試菌上抑菌圈的直徑（結(jié)果為3次平行實驗的平均值），結(jié)果如表1。

表1 乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌效果Table 1 Inhibitory effect of lactic acid bacteria fermentation product

由于發(fā)酵培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%CaCO3，能充分中和乳酸，測離心后發(fā)酵液上清的pH值，均在5.0以上，可以排除乳酸對受試菌株的抑制作用，抑菌圈大小能較好的反映出菌體產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的能力。B94和B101的發(fā)酵液對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長均有較好的抑制作用，B125對3種受試菌株都沒有抑制作用，B99、B131和B142對部分受試菌株有一定的抑制作用。

2.5 乳酸菌產(chǎn)生物胺能力試驗

觀察液體脫羧酶培養(yǎng)基顏色變化：菌株不產(chǎn)生生物胺，則培養(yǎng)基呈現(xiàn)黃色，為陰性結(jié)果。菌株產(chǎn)生生物胺，培養(yǎng)基呈現(xiàn)紫色或者紫紅色，為陽性結(jié)果。從表2中可以看出，B101在加入組氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的液體脫羧酶培養(yǎng)基中不產(chǎn)生物胺，其他幾株菌均有生物胺產(chǎn)生。

表2 測試菌產(chǎn)生物胺情況Table 2 Strains activity of producing BA

綜合浸米水產(chǎn)酸、抑菌試驗和生物胺產(chǎn)生試驗，B101是一株適合生物酸化浸米菌株。

2.6 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

以通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳，得到約1 500 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖2）。將B101菌株的16S rRNA序列結(jié)果輸入GenBank用Blast軟件進(jìn)行序列同源性比較，用MEGA5軟件對測序結(jié)果與同源種屬代表菌株的的16S rRNA采用Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 （圖3），B101與Lactobacillus plantarum subsp.plantarum strain ST-Ⅲ親緣關(guān)系最近，可初步確定B101號菌株為Lactobacillus plantarum。

圖2 B101的16S rRNA的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR products of 16S rRNA of B101

圖3 B101的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the complete 16S rRNA sequence of strain B101

2.7 菌株生理特性研究

將B101以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入MRS培養(yǎng)基中，每隔3 h取樣，測其pH值、A600nm和總酸，繪制產(chǎn)酸曲線和生長曲線，結(jié)果見圖4。

從圖4中可以看出pH值在0～12 h迅速下降，12～21 h下降速度緩慢，21 h后保持穩(wěn)定在3.6左右；0～12 h產(chǎn)酸速度較快，之后酸度增加較慢，到33 h后基本保持不變。B101的菌體量在培養(yǎng)了12 h后達(dá)到最大值，12～18 h菌體量基本不變，18h后略微降低。

圖4 L.plantarum B101的pH變化、生長、產(chǎn)酸曲線Fig.4 Growth curves、ability of producing acid and pH changes of L.plantarum B101

生長初期，培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分豐富，生長條件適宜，菌體迅速生長，產(chǎn)酸速度也較快。隨著菌體的生長，營養(yǎng)物質(zhì)被消耗，乳酸的產(chǎn)生，降低了生長環(huán)境的pH值，菌體的生長受到抑制，產(chǎn)酸速度也減緩。18 h時發(fā)酵液中的pH降低到3.7左右，受pH的影響，乳酸菌出現(xiàn)菌體的自溶，菌濃降低，產(chǎn)酸速度緩慢。

2.8 生物酸化浸米

使用B101進(jìn)行生物酸化浸米。如圖5所示，左為自然浸米，右為接種的生物酸化浸米。自然浸米的浸米水氣味不宜，表面出現(xiàn)了較多的泡沫，而且出現(xiàn)了“白花”狀物質(zhì)，顯微鏡下觀察“白花”為絲狀真菌；生物酸化浸米的浸米水品質(zhì)比較均一，無泡沫和“白花”出現(xiàn)，而且氣味比較宜人。

圖5 自然浸米與生物酸化浸米的比較Fig.5 Comparison of natural soaking and biological acidification soaking with LAB

由表3可以看出，生物酸化浸米浸米水pH值明顯低于自然浸米，酸度明顯高于自然浸米；通過平行樣品中的誤差分析可以看出，生物酸化浸米，各個平行間波動小，穩(wěn)定性良好，而自然發(fā)酵浸米過程控制相同的發(fā)酵條件，穩(wěn)定性較差。添加乳酸菌進(jìn)行生物酸化浸米可以加快米漿水升酸速度，且在一定程度上解決自然發(fā)酵浸米過程中穩(wěn)定性差的問題。

由表4可以看出，使用生物酸化浸米，浸米水中腐胺和尸胺的質(zhì)量濃度明顯降低，總的生物胺質(zhì)量濃度降低了52.7%。

表3 浸米水總酸質(zhì)量濃度和pH值Table 3 pH and acidity of seriflux

表4 浸米水中生物胺質(zhì)量濃度Table 4 Mass concentration AB in seriflux（mg/L）

3 結(jié)語

從黃酒釀造環(huán)節(jié)的樣品中分離篩選得到優(yōu)良乳酸菌B101，經(jīng)16S rRNA寡核苷酸堿基序列分析鑒定菌株為植物乳酸菌。此菌具有較廣的抑菌作用，且生物胺反應(yīng)陰性，其在生物酸化浸米過程中可以快速提高米漿水的酸度，縮短浸米時間，并抑制雜菌的生長，提高浸米過程的穩(wěn)定性，且有效的降低米漿水中生物胺質(zhì)量濃度，是一株極具工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用價值的生物酸化菌株。

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