PPARα、PPARγ 在左卡尼汀改善結(jié)腸癌小鼠惡病質(zhì)中的作用*

張 祎 易蘇紅 蔣 芳 仇月華 陳漢章 劉 蘇＆ 朱 樑

第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院消化科1 (200003) 上海市閘北區(qū)中心醫(yī)院消化科2 病理科3

惡病質(zhì)是晚期惡性腫瘤患者的常見并發(fā)癥，病死率高達(dá)80%，目前認(rèn)為全身慢性炎癥和代謝紊亂在惡病質(zhì)的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。左卡尼汀(LC)是人體細(xì)胞的一種基本成分，是脂肪酸代謝必需的輔助因子。有研究［1，2］結(jié)果顯示，腫瘤惡病質(zhì)患者體內(nèi)血清LC 含量嚴(yán)重不足，補(bǔ)充外源性LC 可改善惡病質(zhì)狀態(tài)。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)具有調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝等的生物學(xué)功能。本研究通過補(bǔ)充外源性LC 干預(yù)結(jié)腸癌小鼠惡病質(zhì)模型，并觀察肝臟PPARα、PPARγ 表達(dá)，旨在探討PPARα、PPARγ 在LC 改善結(jié)腸癌小鼠惡病質(zhì)中的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物和主要試劑

36 只SPF 級健康雄性BALB/c 小鼠由上海第二軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供，體質(zhì)量22～26 g，常規(guī)喂養(yǎng)。

LC(東北制藥總廠);左卡尼汀棕櫚酸酰基轉(zhuǎn)移酶(CPT)抑制劑(ICL)乙莫克舍(上海洽姆儀器科技有限公司);小鼠結(jié)腸腺癌Colon26 實(shí)體腫瘤(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院);腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6 ELISA 試劑盒(R＆D 公司);TRIzol(Invitrogen 公司);一步法SYBR Green Ⅰ實(shí)時熒光定量PCR 試劑盒(Takara);PPARα 上游引物為5'-CTG TGG GCT CAC TGT TCT-3’，下游為5'-AGG GCT CAT CCT GTC TTT-3’，片度長度164 bp，PPARγ 上游引物為5'-GCC CAA GTT CGA GTT TGC-3’，下游為5'-CTG GCT GTC AGG GTG GTT-3’，片段長度193 bp，GAPDH 上游引物為5'-TGG TGG ACC TCA TGG CCT AC-3’，下游為5'-GCA ACT GAG GGC CTC TCT-3’，片段長度203 bp，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;PPARα、PPARγ和β-actin 抗體(美國Abcam 公司)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.結(jié)腸癌小鼠惡病質(zhì)模型建立:將36 只小鼠隨機(jī)分為惡病質(zhì)模型組(TB)(n=24)、正常對照組(NTB)(n=12)，小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠1 只。取新鮮Colon26 實(shí)體腫瘤組織，每50 mg 腫瘤組織中加入0.1 mL 0.9% NaCl 溶液，制成濃度約1 ×107/mL 的細(xì)胞懸液。TB組小鼠皮下注射Colon26 結(jié)腸腺癌細(xì)胞懸液0.1 mL，NTB組小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不予任何處理。接種后第11 d，兩組各取6 只小鼠處死，測定生存狀態(tài)、體質(zhì)量、攝食量(固定每天上午10 時給予500 g 飼料，次日上午11 時測定盒內(nèi)剩余飼料，每日攝食量=500 g -次日剩余飼料重量)、去瘤體質(zhì)量、左側(cè)腓腸肌質(zhì)量(自肌肉起點(diǎn)至終點(diǎn)全部取出)、雙側(cè)附睪脂肪質(zhì)量(用剪刀剝離全部分離取出)，同時檢測血清TNF-α、IL-6 含量，以此判斷是否成功制備惡病質(zhì)模型［3，4］。

2.藥物干預(yù)和標(biāo)本采集:建立惡病質(zhì)模型后，18 只TB組小鼠隨機(jī)分為LC組、ILC組、陰性對照組(NST)，每組各6 只，并以剩余6 只NTB組小鼠作為正常對照。LC組小鼠給予LC 9 mg/kg 灌胃;ILC組給予乙莫克舍20 mg/kg 腹腔注射;NST組給予0.9% NaCl 溶液9 mg/kg 灌胃;NTB組不予任何處理，連續(xù)干預(yù)7 d。實(shí)驗(yàn)第19 d 斷頸處死小鼠，眼眶取血并分離血清-20 ℃保存待用;取肝臟組織置液氮凍存。測定小鼠攝食量、去瘤體質(zhì)量和瘤體質(zhì)量;取小鼠左側(cè)腓腸肌、雙側(cè)附睪脂肪稱重。

3.血清營養(yǎng)指標(biāo)測定:血清白蛋白、血糖、膽固醇水平采用全自動生化儀AU400(Olympus)檢測。

4.ELISA 法:將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋后配成梯度標(biāo)準(zhǔn)液，取10 μL 待測樣本和40 μL 樣本稀釋液加入樣本孔，37 ℃溫育30 min 后棄孔中液體，洗滌后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，37 ℃溫育30 min，顯色液顯色，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長處測定吸光度(A)值，根據(jù)樣品A 值在標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上查出相應(yīng)TNF-α、IL-6 含量。

5.實(shí)時定量PCR 法:TRIzol 試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，行PCR 擴(kuò)增。實(shí)時定量PCR 反應(yīng)體系20 μL，包含總RNA 2 μL，10 μmol/L 上下游引物各0.8 μL，50×熒光定量PCR 參比燃料0.4 μL，一步法酶混合液0.8 μL，2×一步法擴(kuò)增緩沖液10 μL，加ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃10 min;95 ℃5 s，54 ℃30 s，72 ℃45 s，共40個循環(huán)。連續(xù)監(jiān)測熒光信號變化進(jìn)行熔解曲線分析，以GAPDH 作為內(nèi)參照行相對定量分析，采用2-△△Ct法計算樣本PPARα、PPARγ 基因表達(dá)量。

6.蛋白質(zhì)印跡法:肝臟標(biāo)本常規(guī)勻漿、離心制備組織蛋白抽提液，BCA 法蛋白定量。變性后上樣，經(jīng)電轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)膜、5% 脫脂奶粉溫室封閉，加入PPARα(1∶1000)，PPARγ(1∶400)4 ℃搖床過夜;加入二抗(1∶5000)溫室孵育1 h，顯色、顯影、定影。同時檢測β-actin 表達(dá)量作為內(nèi)參照。每份樣本單獨(dú)分析，重復(fù)3 次。采用BandScan 5.0 軟件，目的蛋白的表達(dá)以目的條帶積分光密度值與內(nèi)參照的比值表示。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件，每組資料分別進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的資料以ˉx ±s 表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、結(jié)腸癌小鼠惡病質(zhì)模型建立

接種6～7 d 后，成瘤率100%。NTB組小鼠攝食量、活動度、毛色持續(xù)正常狀態(tài)，體型略胖;TB組小鼠接種后活動度減少、遲緩，毛色逐漸灰暗，攝食量逐漸減少。實(shí)驗(yàn)第11 d，TB組體質(zhì)量、去瘤體質(zhì)量、攝食量、左側(cè)腓腸肌質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量均顯著低于NTB組(P ＜0.01)，其中去瘤體質(zhì)量較NTB組小鼠減輕20%以上，血清TNF-α和IL-6 水平顯著高于NTB組(P ＜0.01)(見表1)，說明TB組小鼠達(dá)惡病質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，模型制備成功。

二、LC 改善荷瘤小鼠惡病質(zhì)的作用

1.惡病質(zhì)指標(biāo)變化:以藥物干預(yù)7 d 后，LC組小鼠攝食量和活動度明顯高于干預(yù)前以及干預(yù)后NST組和ILC組，毛色晦暗和體型瘦弱程度亦明顯好轉(zhuǎn)。NST組、ILC組、LC組小鼠體質(zhì)量、去瘤體質(zhì)量、左側(cè)腓腸肌質(zhì)量和附睪脂肪質(zhì)量均顯著低于NTB組(P ＜0.05，P ＜0.01)，LC組又顯著高于NST組、ILC組(P ＜0.05，P ＜0.01);NST組、ILC組攝食量顯著低于NTB組(P ＜0.01)，LC組與NTB組之間無明顯差異(P ＞0.05)，但顯著高于NST組、ILC組(P ＜0.01，P ＜0.05);NST組、ILC組、LC組瘤體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)(見表2)。

2.血清學(xué)指標(biāo)變化:NST組、ILC組血清白蛋白含量均顯著低于NTB組和LC組(P ＜0.05，P ＜0.01)，而LC組與NTB組無明顯差異(P ＞0.05);NST組、ILC組膽固醇含量均顯著高于NTB組和LC組(P ＜0.05，P ＜0.01)，而LC組與NTB組無明顯差異(P ＞0.05);NST組、ILC組、LC組血糖含量顯著低于NTB組(P ＜0.01，P ＜0.05)，LC組顯著高于NST組、ILC組(P ＜0.05);NST組、ILC組、LC組血清TNF-α、IL-6 含量均顯著高于NTB組(P ＜0.01)，LC組顯著低于NST組、ILC組(P ＜0.01)(見表3)。

三、LC 對肝臟PPARα、PPARγ 表達(dá)的影響

1.PPARα、PPARγ mRNA 表達(dá):LC組小鼠肝臟組織PPARα mRNA 表達(dá)顯著高于NTB組、NST組、ILC組(P ＜0.05)，NST組、ILC組又顯著低于NTB組(P ＜0.05)。NST組、LC組、ILC組肝臟組織PPARγ mRNA 表達(dá)顯著低于NTB組(P ＜0.05)，LC組又顯著高于NST組、ILC組(P ＜0.05)(見圖1)。

2.PPARα、PPARγ 蛋白表達(dá):LC組肝臟組織PPARα 蛋白表達(dá)顯著高于NTB組、NST組、ILC組(P ＜0.05)，NST組、ILC組又顯著低于NTB組(P ＜0.05)。NST組、LC組、ILC組肝臟組織PPARγ 蛋白表達(dá)顯著低于NTB組(P ＜0.05)，LC組又顯著高于NST組、ILC組(P ＜0.05)(見圖2、3)。

表1 NTB組和TB組小鼠惡病質(zhì)指標(biāo)的比較()

表1 NTB組和TB組小鼠惡病質(zhì)指標(biāo)的比較()

＊＊與NTB組比較，P ＜0.01

表2 各組小鼠惡病質(zhì)指標(biāo)變化(，g)

表2 各組小鼠惡病質(zhì)指標(biāo)變化(，g)

與NTB組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與NST組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與ILC組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

表3 小鼠血清學(xué)指標(biāo)的變化()

表3 小鼠血清學(xué)指標(biāo)的變化()

與NTB組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與NST組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與ILC組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

圖1 小鼠肝臟組織PPARα、PPARγ mRNA 表達(dá)

圖2 小鼠肝臟組織PPARα、PPARγ 蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)電泳圖)

圖3 小鼠肝臟組織PPARα、PPARγ 蛋白的平均灰度值

討 論

腫瘤惡病質(zhì)致死率高達(dá)80%，有效治療惡病質(zhì)成為臨床難點(diǎn)。惡病質(zhì)的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，可能與代謝異常、致炎細(xì)胞因子、全身炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、瘦素和神經(jīng)肽等諸多因素有關(guān)［5，6］。其中脂質(zhì)代謝異常在惡病質(zhì)發(fā)生中起重要作用［7］。惡病質(zhì)狀態(tài)下機(jī)體表現(xiàn)為脂質(zhì)分解增加，合成減少，游離脂肪酸、膽固醇和三酰甘油增高。同時，TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 等內(nèi)源性細(xì)胞因子表達(dá)亦增高［8］。目前惡病質(zhì)的治療主要為緩解癥狀的經(jīng)驗(yàn)性治療，但療效不穩(wěn)定，且存在一些不良反應(yīng)。如最早使用的孕激素類藥物能有效增加患者體重，改善食欲，減輕癌痛等惡病質(zhì)表現(xiàn)，但易誘發(fā)血栓形成、子宮出血、外周水腫、高血壓、腎上腺功能減退(突然停藥時)等不良反應(yīng)［9］。新近LC 治療腫瘤惡病質(zhì)的療效日漸受到關(guān)注，LC 是脂肪酸代謝必需輔助因子，通過CPT 發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。LC 為水溶性營養(yǎng)素，不良反應(yīng)少見。近年LC 已應(yīng)用于慢性心衰、腎衰竭血液透析、脂質(zhì)沉積等疾病的治療，能明顯改善患者心衰癥狀以及心功能，改善急性腎功能衰竭患者的腎功能，改善慢性腎衰竭血液透析患者低蛋白血癥和貧血［10～13］。有研究發(fā)現(xiàn)，惡病質(zhì)患者因進(jìn)食不足、代謝異常以及抗腫瘤藥物干擾等因素，體內(nèi)LC 含量嚴(yán)重不足［6］。程晴等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，42例肝癌晚期伴有惡病質(zhì)患者的血清游離LC、乙酰基LC和丙?；鵏C 均顯著降低，且血清游離LC 與前白蛋白、白蛋白、BMI、KPS 功能狀態(tài)評分和QOL 評分均呈正相關(guān)。說明血清LC 水平降低是惡病質(zhì)的結(jié)果，LC 可能在某種程度上反映了惡病質(zhì)的程度。國外有研究［15，16］給予癌癥患者口服LC 1 周后，疲勞癥狀明顯改善，綜合評分、軀體評分以及生活質(zhì)量評分中與氧化應(yīng)激相關(guān)的疲勞指標(biāo)均顯著改善;Mantovani 等［2］對惡病質(zhì)治療藥物的Ⅲ期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予LC(4 g/d)治療的88例惡病質(zhì)患者的格拉斯哥預(yù)后評分(GPS)顯著降低。Liu 等［17］的動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，惡病質(zhì)小鼠補(bǔ)充外源性LC 后血清卡尼汀含量升高，TNF-α、IL-6 含量降低，CPTⅠ、CPTⅡmRNA 表達(dá)增加、肝臟CPTⅠ酶活性升高，從而促進(jìn)脂肪酸氧化，調(diào)節(jié)惡病質(zhì)代謝紊亂。上述研究說明補(bǔ)充外源性LC 可能對預(yù)防或治療腫瘤惡病質(zhì)有一定作用。本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充外源性LC 能增加結(jié)腸癌惡病質(zhì)小鼠體質(zhì)量、去瘤體質(zhì)量、攝食量、左側(cè)腓腸肌質(zhì)量和附睪脂肪質(zhì)量，增加血清白蛋白、血糖含量，降低膽固醇含量，調(diào)節(jié)惡病質(zhì)狀態(tài)下的代謝紊亂，降低血清TNF-α、IL-6 含量，上述指標(biāo)與NST組和ILC組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。提示LC 可改善惡病質(zhì)小鼠的生存狀態(tài)，增加攝食量，促進(jìn)體質(zhì)量恢復(fù)，減輕骨骼肌萎縮，調(diào)節(jié)代謝紊亂等，且證實(shí)了LC 發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)是通過CPT 來實(shí)現(xiàn)的。但LC 改善腫瘤惡病質(zhì)的機(jī)制卻仍不清楚。

PPAR 是調(diào)節(jié)目標(biāo)基因表達(dá)的核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，根據(jù)結(jié)構(gòu)不同，可分為α、β(或δ)和γ 三種類型。PPAR 與肝臟脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，目前的研究熱點(diǎn)主要是PPARα和PPARγ。PPARα 主要在肝臟中表達(dá)，能增強(qiáng)脂肪酸β 氧化;PPARγ 主要在脂肪組織和肝臟中表達(dá)，可促進(jìn)脂肪酸在脂肪組織中沉積和脂肪細(xì)胞分化，從而增加靶組織對胰島素的敏感性。PPARα 的合成激動劑苯氧乙酸酯通過刺激肝臟中脂肪酸氧化，能顯著降低血漿三酰甘油水平，增加高密度脂蛋白水平，已被廣泛用于心血管疾病的治療。PPARγ 的合成激動劑噻唑二酮可降低血糖水平，臨床已用于Ⅱ型糖尿病的治療。有研究［18］顯示，PPARγ 激動劑能放大胰島素信號級聯(lián)反應(yīng)，改善惡病質(zhì)狀態(tài)下的代謝紊亂，可成為治療惡病質(zhì)的新藥。

惡病質(zhì)狀態(tài)下機(jī)體能量需求增加，基礎(chǔ)代謝率增高，導(dǎo)致血糖水平降低，骨骼肌蛋白大量消耗，脂肪酸含量增加，外周血膽固醇、三酰甘油含量增加。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)惡病質(zhì)狀態(tài)下小鼠脂肪代謝異常，附睪脂肪質(zhì)量降低，血清膽固醇水平升高，小鼠肝臟中PPARα、PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)降低;給予LC 干預(yù)治療后，上述指標(biāo)均明顯改善。PPARα、PPARγ主要的生物學(xué)效應(yīng)是刺激β 氧化，降低脂肪酸和三酰甘油合成，糾正脂質(zhì)代謝，進(jìn)一步證實(shí)了在惡病質(zhì)狀態(tài)下脂質(zhì)代謝紊亂，而LC 可能通過調(diào)控PPAR表達(dá)來糾正脂質(zhì)代謝，從而改善腫瘤惡病質(zhì)狀態(tài)。

綜上所述，惡病質(zhì)小鼠肝臟PPARα、PPARγ 表達(dá)降低，給予外源性LC 后可增強(qiáng)其表達(dá)，改善惡病質(zhì)小鼠的脂質(zhì)代謝。說明LC和PPAR 激動劑可能在治療腫瘤惡病質(zhì)中存在潛在的藥學(xué)效應(yīng)，為腫瘤惡病質(zhì)的防治開發(fā)新途徑和方法。但目前仍有許多問題亟待深入研究，如PPAR 在腫瘤細(xì)胞增殖和分化中的確切作用，LC-PPAR 信號通路是否存在其他關(guān)鍵點(diǎn)，如何選擇性控制PPAR 介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)等。

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