無(wú)患子種質(zhì)資源多樣性與親緣關(guān)系的ISSR 和SRAP 分析

洪 莉，柏明娥，張加正，洪利興，沈建軍

(1.浙江省臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 臨海 317000;2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023)

無(wú)患子 (Sapindus mukorossi Gaertn.)又名肥皂樹，為無(wú)患子科無(wú)患子屬落葉喬木樹種，廣泛分布我國(guó)東部、南部至西南各省區(qū)，日本、朝鮮、越南、老撾、柬埔寨、緬甸、泰國(guó)、馬來(lái)西亞、尼泊爾和印度也有分布［1］。近年來(lái)研究表明，無(wú)患子果皮含有四環(huán)三萜類大戟烷型 (Tirucallane type)和達(dá)瑪烷型 (Dammarane type)等多種皂苷［2-4］，可作為天然活性物質(zhì)用于洗滌和洗發(fā)香波及各種潔膚護(hù)膚化妝品中，具有抗皮真菌和念珠菌等抗菌、止癢、治療腳癬和輪癬等功效［5］，是當(dāng)前日用化工業(yè)中非常引人關(guān)注的綠色洗滌生物化工原料，市場(chǎng)前景廣闊。目前，人工種植的無(wú)患子大多使用天然種源的實(shí)生苗，良種選育尚處于起步階段。辜夕蓉［6］對(duì)來(lái)自于四川和云南5個(gè)地方的無(wú)患子種源的種子品質(zhì)進(jìn)行研究和比較，以期從中找尋出優(yōu)良種源，為無(wú)患子的栽后產(chǎn)量和品質(zhì)打下基礎(chǔ)。邵文豪等［7-8］通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地?zé)o患子果皮皂苷含量的測(cè)定分析和收集無(wú)患子自然分布區(qū)內(nèi)不同種源、家系種子進(jìn)行播種育苗定期觀測(cè)，研究無(wú)患子不同種源皂苷含量和苗期生長(zhǎng)變異規(guī)律與種源地生態(tài)因子之間的關(guān)系，以期為選擇高皂苷含量的優(yōu)良種源區(qū)劃及遺傳改良提供理論依據(jù)。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間 (inter-simple sequence repeat，ISSR)是1994年由Zietkeiwitcz 創(chuàng)建的一種簡(jiǎn)單序列重復(fù)間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記方法［9］，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性 (sequence-related amplified polymorphism，SRAP)是由美國(guó)加州大學(xué)Li 和Quiros 于2001年發(fā)展的一種基于PCR 反應(yīng)的新型標(biāo)記［10］。利用分子標(biāo)記技術(shù)研究無(wú)患子種質(zhì)資源遺傳多樣性的相關(guān)文獻(xiàn)鮮見報(bào)道。本研究采用ISSR 和SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)，選取來(lái)自浙江、湖南、四川等地的16 份無(wú)患子材料，通過(guò)探討不同產(chǎn)地?zé)o患子種源間的遺傳差異和親緣關(guān)系，旨在為科學(xué)實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交或遠(yuǎn)親雜交提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2011年11-12月，在無(wú)患子不同分布區(qū)選擇樹齡20年以上、胸徑18 cm 以上且生長(zhǎng)正常的無(wú)患子采集成熟果實(shí)，共收集13個(gè)產(chǎn)地16 份果實(shí)材料 (表1)。果實(shí)采集帶回室內(nèi)，將種子剝離后濕沙埋藏，2012年3月進(jìn)行播種試驗(yàn)。試驗(yàn)在浙江省臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院大棚內(nèi)進(jìn)行。臺(tái)州屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候，四季分明，年均氣溫17℃，年降水量1 550 mm。土壤為砂壤土，pH 值6.1，地勢(shì)平坦，水源充足。2012年9月采集當(dāng)年生幼樹嫩葉作分析測(cè)試樣品。

表1 供試無(wú)患子材料的情況

1.2 處理方法

1.2.1 無(wú)患子基因組DNA 的提取

基因組DNA 提取采用SDS-CTAB 法，DNA 粗提物再經(jīng)Magabio 核酸純化試劑盒進(jìn)行純化后，通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和DNA/RNA 紫外分光光度計(jì) (GeneQuant Pro，GE Healthcare)檢測(cè)完整性、純度及濃度。D260/D280＞1.8 的DNA 樣品用于后續(xù)PCR 擴(kuò)增。

1.2.2 ISSR 引物的選用和PCR 的擴(kuò)增

ISSR 和SRAP 通用引物如表2 所示。

表2 ISSR 和SRAP 通用的引物序列

ISSR 和SRAP 擴(kuò)增反應(yīng)均采用20 μL 體系。2.0 μL 10× PCR Buffer，2.0 μL dNTP (each 2.5 mmol·L-1)，1.2 μL MgCl2(25 mmol·L-1)，0.2 μL Taq DNA 聚合酶(1U)，模板DNA 60 ng，ISSR 引物1 μL (10 μmol·L-1)或SRAP 上下游引物各1 μL (10 μmol·L-1)，dd H2O 補(bǔ)足20 μL。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在杭州博日公司的TC-XP 型擴(kuò)增儀上進(jìn)行。ISSR-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min;94℃變性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7 min，4℃保存。SRAP-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共5個(gè)循環(huán)，隨后94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)結(jié)束后72℃延伸8 min，4℃保存。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，用Quantity One 6.0 分析軟件結(jié)合人工方法讀帶，記錄電泳圖譜中清晰且能重復(fù)出現(xiàn)的條帶，在相同的遷移位置上，有帶用1 表示，無(wú)帶用0 表示。采用NTSYS-pc2.10e 軟件的Simqual 程序計(jì)算樣品間的Dice 相似系數(shù)，同時(shí)用類平均聚類法 (UPGMA)進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)患子種質(zhì)的ISSR 和SRAP 分析

用優(yōu)選出的13 條ISSR 隨機(jī)引物和3 對(duì)SRAP引物 (Me3-em7、Me3-em15、Me3-em17)對(duì)無(wú)患子基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果均能擴(kuò)展出清晰穩(wěn)定、重復(fù)性和多態(tài)性較高的條帶 (圖1-2)。不同引物擴(kuò)增的DNA 片段為300～1 300 bp，DNA片段數(shù)目為2～12 條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出5 條主帶，多態(tài)性條帶比率約為61%。

圖1 ISSR 引物UBC862 的PCR 擴(kuò)增圖譜

圖2 SRAP 引物對(duì)Me3-em7 的PCR 擴(kuò)增圖譜

2.2 遺傳相似系數(shù)的估算和聚類分析

圖3 為通過(guò)Dice 相似系數(shù)利用UPGMA 法構(gòu)建的不同產(chǎn)地間無(wú)患子種質(zhì)聚類分析樹狀圖。

圖3 16個(gè)無(wú)患子種質(zhì)的UP GMA 聚類樹

聚類結(jié)果顯示，當(dāng)Dice 相似系數(shù)為0.52 時(shí)，可將供試的無(wú)患子種質(zhì)分為2個(gè)大類，第1 大類包括了15個(gè)無(wú)患子種質(zhì)，第2 大類僅為四川成都1號(hào)1個(gè)種質(zhì);當(dāng)Dice 相似系數(shù)為0.678 時(shí)，可以將第1 大類再分為2個(gè)亞類，第1 亞類包括來(lái)自福建和江西的3個(gè)無(wú)患子種質(zhì)，第2 亞類包括來(lái)自浙江、湖南、湖北、安徽、四川、江西、福建的12個(gè)無(wú)患子種質(zhì)。在第1 亞類中，來(lái)自福建三明和福建順昌的無(wú)患子種質(zhì)以0.828 的Dice 相似系數(shù)聚在一起;在第2 亞類中，來(lái)自浙江金華和浙江麗水的無(wú)患子種質(zhì)以0.854 的Dice 相似系數(shù)聚在一起，來(lái)自江西廬山和浙江臨安的以0.802 的Dice 相似系數(shù)聚在一起，來(lái)自安徽黃山和浙江臨海的以0.854 的Dice 相似系數(shù)聚在一起。從以上聚類結(jié)果可以看出，各無(wú)患子種質(zhì)并未嚴(yán)格按地理界限聚在一起，僅部分來(lái)源于同一地區(qū)的無(wú)患子種質(zhì)聚在一起，出現(xiàn)“大雜居、小聚居”的現(xiàn)象。

3 小結(jié)和討論

利用ISSR 和SRAP 分子技術(shù)對(duì)16個(gè)地區(qū)無(wú)患子種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，PCR 擴(kuò)增圖譜上存在明顯的多態(tài)性，說(shuō)明利用ISSR 和SRAP 標(biāo)記可以從分子水平上揭示出不同產(chǎn)地?zé)o患子的基因組差異，在無(wú)患子種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性研究上具有重要價(jià)值。本研究中無(wú)患子種質(zhì)的多態(tài)性比率約為61%，表明分布于不同產(chǎn)地的無(wú)患子具有較高的遺傳多樣性，各分布區(qū)的個(gè)體遺傳差異較大，這可能與其具有很強(qiáng)的適應(yīng)不同氣候環(huán)境的能力相關(guān)。

在親緣關(guān)系上，遺傳距離越小，遺傳一致性越大，材料間的親緣關(guān)系也就越近，反之，親緣關(guān)系就較遠(yuǎn)。在本研究的16個(gè)無(wú)患子種質(zhì)中，親緣關(guān)系最近的是在第2 亞類中聚在一起的分布于浙江麗水和金華的種質(zhì)，以及分布于安徽黃山和浙江臨海的種質(zhì)。其次，分布于福建三明和順昌的種質(zhì)，以及分布于江西廬山和浙江臨安的種質(zhì)也有著較近的親緣關(guān)系，這些分布區(qū)的地理距離相對(duì)較近。親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是分布于福建三明和四川成都的種質(zhì)，相對(duì)地理距離較遠(yuǎn)。此外，基于2種分子標(biāo)記得到的無(wú)患子種質(zhì)聚類結(jié)果并不與其地理分布一致，如同是分布于四川成都和湖南長(zhǎng)沙的種質(zhì)并未聚在一起，顯示了較大的基因組差異，表明無(wú)患子種質(zhì)的遺傳變異與地理分布沒有呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性。

無(wú)論ISSR 和SRAP 分子圖譜還是分子聚類結(jié)果，均顯示四川成都1號(hào)種質(zhì)與其他種質(zhì)在分子水平上存在明顯差異，這為我們后續(xù)在無(wú)患子的雜交育種計(jì)劃中親本選擇提供了優(yōu)先選擇的材料。

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