肺積方調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg 細胞及T 淋巴細胞增殖與抗Lewis 肺癌移植鼠腫瘤生長作用研究

楊國良 張學(xué)進 浙江省杭州市紅十字會醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 杭州310003

胡丹丹 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸科

腫瘤的發(fā)展與宿主的細胞免疫狀態(tài)密切相關(guān)。機體存在著多種免疫監(jiān)視機制，發(fā)揮抗癌作用，包括特異性和非特異性的、細胞的和體液的免疫機制，其中以T 細胞亞群為主的細胞免疫起著重要作用。免疫治療是肺癌綜合治療手段中重要的組成部分。施志明教授研制的肺積方，經(jīng)臨床長期使用研究及相關(guān)實驗研究，業(yè)已證實其在改善患者癥狀和生存質(zhì)量方面有明顯作用，并能逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫逃逸，提高機體細胞免疫功能。但是該方調(diào)節(jié)腫瘤免疫的具體作用機制尚不明確。本研究通過觀察該方抗Lewis 肺癌移植鼠腫瘤生長，以及對移植鼠CD4+CD25+Treg 細胞數(shù)量、T 淋巴細胞增殖的影響，探討該方調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫的機制，為該方的進一步研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動 物 近交系C57BL/6 純系小鼠，64 只，雄性，體質(zhì)量18～22g，4～6 周齡。

1.2 藥 物 肺積方由生黃芪、白術(shù)、七葉一枝花、萸肉、仙靈脾等組成，由本院中藥房提供。常規(guī)水煎，濃縮至生藥含量為2.0g/mL，4℃保存。順鉑（DDP）：20mg/瓶。

1.3 細胞培養(yǎng) Lewis 肺癌細胞株由北京酶阿查生物控股有限公司提供，常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的IMDM 培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 小鼠Lewis 肺癌模型建立 將制備好的Lewis肺癌細胞懸液以0.2mL/只接種于小鼠右腋皮下（約含活細胞數(shù)1.5×106個）

1.5 動物分組及給藥 接種后小鼠隨機分為對照組、DDP 組、肺積方組、綜合組，每組16 只。接種后第7天（腫瘤長至直徑約5mm 時）開始給藥，給藥劑量根據(jù)人鼠體表面積折合法計算。對照組以生理鹽水（10mL/kg）灌胃14天；DDP 組DDP 溶液1mL（5mg/kg）腹腔注射化療，隔天1天，共3 次，同時生理鹽水0.2mL 灌胃21天；肺積方組予肺積方藥液40g/kg 灌胃21天。綜合組的化療同DDP 組，肺積方用法同肺積方組。各組均每天灌胃1 次。

1.6 觀察成瘤率、平均瘤重、腫瘤體積 接種腫瘤細胞后第7天起，每3天檢測小鼠體質(zhì)量，每3天用游標卡尺測量每只小鼠腋下腫瘤長徑（L）和短徑（W），Tumor volume=（L×W）2/2

1.7 指標檢測 給藥后第10、21天，分兩批（每批每組各8 只），對小鼠進行下列檢測。

1.7.1 MTT 法檢測胸腺和脾臟T 淋巴細胞增殖情況無菌狀態(tài)下取小鼠胸腺和脾臟，制成1×107/mL的細胞懸液，加入96 孔培養(yǎng)板，每孔100μL，加入ConA 使終濃度為5μg/mL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h 后每孔加入5mg/mL MTT 10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加入DMSO（二甲基亞砜）溶解液100μL，在酶標儀上于570nm 讀取吸光度（OD 值）。

1.7.2 流式細胞術(shù)檢測胸腺和脾臟CD4+CD25+Treg細胞含量 通過流式細胞術(shù)檢測胸腺和脾臟CD4+CD25+Treg 細胞數(shù)量。將小鼠頸椎脫臼處死，常規(guī)制備胸腺和脾細胞懸液；Tris-NH4Cl 溶脹紅細胞，計數(shù)，取106個細胞（200μL 體積），加入PE-anti-CD4+5μL 和FITC-anti-CD25+2μL，避光冰浴45min，冷PBS 洗滌2 次后，用流式細胞儀檢測胸腺和脾臟CD4+CD25+Treg 細胞數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 Lewis 肺癌荷瘤小鼠腫瘤體積、體質(zhì)量、腫瘤抑制率變化 給藥21天后，小鼠腫瘤體積、體質(zhì)量、腫瘤生長抑制率變化見圖1～3。以綜合組對荷瘤小鼠腫瘤生長抑制最明顯。

圖1 Lewis 肺癌荷瘤小鼠給藥21天腫瘤體積變化

圖2 Lewis 肺癌荷瘤小鼠給藥21天體質(zhì)量變化

圖3 Lewis 肺癌荷瘤小鼠給藥21天腫瘤生長抑制率變化

2.2 Lewis 肺癌荷瘤小鼠T 細胞增殖功能變化 荷瘤小鼠脾臟T 淋巴細胞增殖指數(shù)變化：第10、21天DDP 組、肺積方組、綜合組T 淋巴細胞增殖與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中肺積方組、綜合組T 淋巴細胞增殖指數(shù)增高，而DDP 組T 淋巴細胞增殖指數(shù)降低；DDP 組給藥后第21天與第10天比較，T 淋巴細胞增殖指數(shù)降低明顯（P＜0.05）；而肺積方組、綜合組第21天與第10天T 淋巴細胞增殖指數(shù)組內(nèi)比較無明顯變化（P＞0.05）。見表1。

荷瘤小鼠胸腺T 淋巴細胞增殖指數(shù)變化：第10、21天DDP 組、肺積方組、綜合組T 淋巴細胞增殖指數(shù)與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中肺積方組、綜合組T 淋巴細胞增殖指數(shù)增高，而DDP 組T 淋巴細胞增殖指數(shù)降低；DDP 組給藥第21天與給藥第10天比較，T 淋巴細胞增殖指數(shù)降低明顯（P＜0.05）；而肺積方組、綜合組T 淋巴細胞增殖指數(shù)第21天與第10天組內(nèi)比較無明顯變化（P＞0.05）。見表2。

表1 小鼠脾臟T 淋巴細胞增殖指數(shù)比較（）

表1 小鼠脾臟T 淋巴細胞增殖指數(shù)比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與DDP 組比較，▲P＜0.05；與DDP 組和肺積方組比較，△P＜0.05；與同組第10天比較，#P＜0.05

表2 四組小鼠胸腺T 淋巴細胞增殖指數(shù)比較（）

表2 四組小鼠胸腺T 淋巴細胞增殖指數(shù)比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與DDP 組比較，▲P＜0.05；與DDP 組、肺積方組比較，△P＜0.05

2.3 Lewis 肺癌荷瘤小鼠胸腺和脾臟CD4+CD25+Terg 細胞比例 荷瘤小鼠胸腺CD4+CD25+Terg 細胞比例變化：第10天、21天DDP 組、肺積方組、綜合組CD4+CD25+Terg 細胞比例與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），肺積方組、綜合組、DDP 組CD4+CD25+Terg 細胞比例均降低；DDP 組第21天與給藥后第10天比較，CD4+CD25+Terg 細胞比例升高（P＜0.05）；而肺積方組、綜合組第21天與第10天比較無明顯變化（P＞0.05）；綜合組與肺積方組、DDP 組比較脾臟CD4+CD25+Terg 細胞比例明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 四組小鼠胸腺CD4+CD25+Treg 細胞比例比較（）

表3 四組小鼠胸腺CD4+CD25+Treg 細胞比例比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與DDP 組比較，▲P＜0.05；與DDP 組、肺積方組比較，△P＜0.05；與同組第10天比較，#P＜0.05

荷瘤小鼠脾臟CD4+CD25+Terg 細胞比例變化：第10、21天DDP 組、肺積方組、綜合組CD4+CD25+Terg細胞比例與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），肺積方組、綜合組、DDP 組CD4+CD25+Terg 細胞比例均降低；DDP 組第21天與給藥后第10天比較，CD4+CD25+Terg 細胞比例升高（P ＜0.05）；而肺積方組、綜合組第21天與第10天比較無明顯變化（P＞0.05）；綜合組與肺積方組、DDP 組脾臟CD4+CD25+Terg 細胞比例比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），綜合組比例較低；肺積方組第10天脾臟CD4+CD25+Terg 細胞比例與DDP 組第10天比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 四組小鼠脾臟CD4+CD25+Treg 細胞比例比較（）

表4 四組小鼠脾臟CD4+CD25+Treg 細胞比例比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與DDP 組比較，▲P＜0.05；與DDP 組、肺積方組比較，△P＜0.05；與同組第10天比較，#P＜0.05

3 討論

肺癌為世界范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤，死亡率高，晚期患者生存期短暫。肺癌治療目前已處于平臺期，手術(shù)放化療治療效果現(xiàn)在難以提高，靶向藥物治療取得了一定的治療效果，但仍難以大幅提高患者生存期。肺癌發(fā)生與腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視密切相關(guān)，而從免疫角度探索肺癌治療新方法可以為肺癌治療提供新的靶點。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cell，Treg）是一類具有獨特免疫調(diào)節(jié)作用的T 細胞。由Sakaguchi 等[1]首次報道。已有相關(guān)研究表明，在某些惡性腫瘤中，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細胞可導(dǎo)致免疫功能混亂，其水平升高與免疫抑制、腫瘤進展有關(guān)[2]。

腫瘤局部存在多種類型的免疫抑制性細胞，其中調(diào)節(jié)性T 細胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著極為重要的作用。Treg 通過多種機制抑制免疫效應(yīng)細胞的功能，是腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵因素之一。這些機制包括分泌抑制性細胞因子抑制效應(yīng)細胞功能、分泌顆粒酶和穿孔素殺傷效應(yīng)細胞、干擾效應(yīng)細胞的代謝功能，以及通過與樹突狀細胞的相互作用影響Treg的分化和增殖。Treg 是一個異質(zhì)性的群體，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種Treg 亞群，包括自然產(chǎn)生的CD4+CD25+Treg、抗原誘導(dǎo)的Thl、Th3 細胞以及抗原特異性CD4+Treg。此外，還有CD8+Treg、CD4+CD25-Treg 等。在腫瘤微環(huán)境中，報道最多的是CD4+CD25+Treg，多種腫瘤包括肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、淋巴瘤等均發(fā)現(xiàn)這群細胞的存在，其數(shù)量因腫瘤的不同而異，而腫瘤局部Treg的數(shù)量與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[3]。

近年來，針對肺癌患者CD4+CD25+Treg 細胞的檢測及觀察顯示，中晚期非小細胞肺癌患者外周血CD4+CD25+Treg 細胞水平明顯高于正常健康人群[4-5]。肺癌患者外周血中CD4+CD25+Treg 細胞數(shù)量與臨床分期關(guān)系密切，肺癌患者體內(nèi)CD4+CD25+Treg 細胞比例上升可能與肺癌發(fā)病有關(guān)，其數(shù)量變化可反應(yīng)肺癌患者荷瘤狀態(tài)[6]。對于不同病理分型的肺癌，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細胞比例也有所不同：腺癌患者比例較高，其次是鱗癌，混合型最低，且肺癌患者隨著病程的進展，CD4+CD25+Treg 細胞也逐漸增高；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯高于未轉(zhuǎn)移者[7]。晚期肺癌患者免疫應(yīng)答受到抑制的原因可能是，腫瘤在其周圍形成了一個獨立的微環(huán)境，在這個微環(huán)境里，所有的細胞似乎都致力于一個目標，即支持和加速腫瘤的生長[8]。而CD4+CD25+Treg 細胞則正因為其可導(dǎo)致免疫功能混亂，且水平升高與免疫抑制、腫瘤進展有關(guān)[9]，故在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，其比例增高可以反映肺癌患者免疫系統(tǒng)存在抑制狀態(tài)，是抑制機體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸，使腫瘤進行性生長的重要因素之一。下調(diào)CD4+CD25+Treg 細胞將有助于提高機體抗腫瘤免疫，減輕腫瘤負荷。

目前針對化療對T 細胞亞群影響的文獻報道較多，但大部分研究均只針對CD3、CD4、CD8 等T 細胞化療前后的比例變化，而對CD4+CD25+Treg 細胞未見相關(guān)文獻報道。而開展腫瘤CD4+CD25+Treg 細胞的研究可為制定有效的抗腫瘤生物治療方法提供幫助。本研究表明，化療后肺癌移植鼠的T 細胞增殖受到明顯抑制，但隨著T 細胞增殖能力的恢復(fù)，CD4+CD25+Treg 細胞比值明顯升高，這是否為化療后腫瘤進展的因素之一，本研究尚不能評價，但本實驗結(jié)果同時表明綜合組CD4+CD25+Treg 細胞比值明顯低于其他三組，這說明化療聯(lián)合中藥治療在調(diào)節(jié)腫瘤T 細胞增殖時是有選擇性的，但這種選擇作用的靶點是什么，仍需進一步實驗研究。

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［5］黃云勝，施志明.CD4+CD25+Tr 細胞與非小細胞肺癌相關(guān)性研究［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2007，15（7）：928-929.

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［8］Okita R，Saeki T，Takashima S，et al.CD4+CD25+regulatory Tcells in the peripheral blood of patients with breast cancer and non-small cell lung cancer［J］.Oncol Rep，2005，14（5）：1269-1273.