負(fù)載pcDNA3.1-EGFP殼聚糖納米顆粒的制備及其生物學(xué)特性分析

邵小青,陳 艷,陳 貝,陳澤燁,奚菊群,龔衛(wèi)娟

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,1.免疫學(xué)教研室;2.藥劑學(xué)教研室,江蘇揚(yáng)州,225001)

“納米凝膠”(Nanogel)是能夠在水溶液中分散并具有納米尺寸的水凝膠顆粒,通常由物理或化學(xué)交聯(lián)的聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)所組成[1]。聚電解質(zhì)納米凝膠可結(jié)合帶有相反電荷的小分子藥物、核酸類藥物及蛋白質(zhì),從而可用于制備新型納米藥物或基因疫苗。納米藥物還具有穩(wěn)定性好、對(duì)胃腸刺激性小、毒副作用小、生物利用度高、具有靶向性和緩釋功能等優(yōu)點(diǎn)[2-4]米凝膠負(fù)載pcDNA3.1或其重組質(zhì)粒后的生物學(xué)效應(yīng),本文制備并鑒定了殼聚糖納米凝膠負(fù)載pcDNA3.1-EGFP重組質(zhì)粒的相關(guān)生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

殼聚糖(脫乙酰度85%,Mv=200000)來(lái)自浙江玉環(huán)海洋生物有限公司,經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室自行修飾為羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖,N-[(2-hydroxy-3-trimethylammonium) propyl]。 CT-26、RAW264.7細(xì)胞株來(lái)自美國(guó)ATCC公司。pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[5]。體Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司,質(zhì)粒大量抽提試劑盒來(lái)自Qiagen公司,細(xì)胞數(shù)目檢測(cè)MTS/PMS試劑盒來(lái)自Promega公司,RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自invitrogen公司,胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。

1.2 方法

1.2.1 負(fù)載質(zhì)粒的殼聚糖納米顆粒制備:利用Qiagen公司大量質(zhì)粒提取試劑盒,測(cè)定質(zhì)粒的濃度和總量,調(diào)整濃度為1 mg/mL,殼聚糖濃度調(diào)整為 1 mg/mL。按1∶0.5,1∶1,1∶2質(zhì)量比,總體積共設(shè)為1 mL。將質(zhì)粒溶液滴加入殼聚糖中,300 rpm,室溫振蕩30 min,混合均勻。4℃離心機(jī)最大速度離心 20～25 min,徹底分離游離DNA和納米顆粒。

1.2.2 納米顆粒包封率測(cè)定:利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)上清中DNA濃度,并根據(jù)體積計(jì)算游離DNA量。納米顆粒包封率的計(jì)算公式為(質(zhì)量總量-游離 DNA量)/質(zhì)量總量 ×100。另外,利用DNA瓊脂糖電泳鑒定游離DNA的量。

1.2.3 納米顆粒粒徑及電位測(cè)定:利用激光動(dòng)態(tài)光閃射儀檢測(cè)納米顆粒的粒徑大小,利用Zeta電位儀檢測(cè)樣品中納米顆粒的電荷狀況,每個(gè)樣品均掃描20次。

1.2.4 納米顆粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及熒光檢測(cè):分別取小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7和腸癌細(xì)胞系CT-26,用無(wú)血清DMEM洗滌接種24孔培養(yǎng)板。次日納米顆粒用DMEM稀釋為20%的濃度,分別加到細(xì)胞培養(yǎng)體系。6、16 h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光細(xì)胞。并且于6、16 h消化細(xì)胞,流式細(xì)胞儀分析綠色熒光細(xì)胞的比例。另外,用商品化脂質(zhì)體包裹相同量的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照,單純質(zhì)粒溶液轉(zhuǎn)染作為陰性對(duì)照。

1.2.5 納米顆粒的細(xì)胞毒性分析:取對(duì)數(shù)期培養(yǎng)的RAW264.7和CT-26細(xì)胞,以每孔5000個(gè)細(xì)胞的數(shù)目加入96孔板內(nèi),每種納米顆粒設(shè)4個(gè)復(fù)孔。于24、72 h后每孔內(nèi)加入20 μ L MTS/PMS試劑,1 h后利用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度值。

2 結(jié) 果

2.1 納米顆粒對(duì)pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒的包封率

不同殼聚糖與質(zhì)粒的質(zhì)量比對(duì)納米顆粒的包封率產(chǎn)生直接影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)殼聚糖:質(zhì)粒的質(zhì)量比為1∶1時(shí),納米顆粒的包封率最高,達(dá)到99%。而兩者質(zhì)量比為1∶2時(shí),納米顆粒的包封率最低(圖1)。取包封后液體的上清進(jìn)行瓊脂糖電泳,僅在殼聚糖與質(zhì)粒質(zhì)量比為1∶2的液體中看到游離的DNA(圖2)。因此,當(dāng)殼聚糖與質(zhì)粒在液體中以合適比例混合、并適度振蕩后,可以高效率地包裹DNA質(zhì)粒。

圖1 殼聚糖-pcDNA3.1-EGFP納米顆粒的包封率分析

圖2 殼聚糖包裹質(zhì)粒體系上清的凝膠電泳結(jié)果

2.2 納米顆粒的大小及Zeta電位測(cè)定

取制備好的納米顆粒溶液,用激光動(dòng)態(tài)光閃射儀檢測(cè)顆粒直徑,結(jié)果顯示3種不同的殼聚糖納米顆粒粒徑均分布在100～300 nm。用Zeta電位儀檢測(cè)納米顆粒的電荷,結(jié)果顯示三種顆粒均攜帶正電荷,范圍分布在40～100 mV(表1)。

表1 殼聚糖納米顆粒的粒徑及Zeta電位分布

2.3 細(xì)胞攝取納米顆粒的活性測(cè)定

將制備好的納米顆粒用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋后,轉(zhuǎn)染RAW264.7和CT-26細(xì)胞,6、16 h分別用熒光顯微鏡觀察熒光細(xì)胞。結(jié)果顯示,當(dāng)加入納米顆粒6 h或16 h后,RAW264.7和CT-26細(xì)胞培養(yǎng)體系中均可觀察到熒光細(xì)胞(圖3,圖5)。并且在相同時(shí)間點(diǎn),將兩種細(xì)胞消化、洗滌,采用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)熒光細(xì)胞頻率,結(jié)果顯示16 h綠色熒光細(xì)胞的頻率較6 h輕度升高(圖4,圖6)。

圖3 殼聚糖納米顆粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞的熒光圖 (100倍)

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)殼聚糖納米顆粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后的表達(dá)效率

圖5 殼聚糖納米顆粒轉(zhuǎn)染CT-26細(xì)胞的熒光圖 (100倍)

圖6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)殼聚糖納米顆粒轉(zhuǎn)染CT-26細(xì)胞后的表達(dá)效率

2.4 納米顆粒的細(xì)胞毒性檢測(cè)

為觀察納米顆粒體內(nèi)運(yùn)用時(shí)潛在的細(xì)胞毒性,將不同質(zhì)量比制備的納米顆粒懸液分別與RAW264.7和CT-26細(xì)胞共培養(yǎng),于 24、72 h利用MTS/PMS法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)活細(xì)胞的數(shù)目,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與單獨(dú)培養(yǎng)基或單純質(zhì)粒相比,納米顆粒對(duì)RAW264.7、CT-26細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響(P>0.05),且不同方法制備的殼聚糖納米顆粒之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。

3 討 論

本研究首先利用殼聚糖材料,制備運(yùn)載重組基因表達(dá)載體的納米顆粒,初步檢測(cè)了納米顆粒的粒徑和電位。其次,將納米顆粒加入細(xì)胞培養(yǎng)體系,證實(shí)該負(fù)載熒光蛋白表達(dá)基因的納米顆粒可被細(xì)胞攝取、并在細(xì)胞內(nèi)得到表達(dá)。最后發(fā)現(xiàn)這些殼聚糖納米顆粒對(duì)細(xì)胞的體外生長(zhǎng)沒(méi)有明顯毒性。該研究結(jié)果說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所用的殼聚糖納米顆粒制備方法簡(jiǎn)單、易行,還提示基于pcDNA3.1質(zhì)粒載體構(gòu)建的納米顆?？杀欢喾N細(xì)胞攝取并表達(dá),為利用納米材料運(yùn)載基因疫苗提供直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

腫瘤部位存在免疫細(xì)胞缺陷,其血管具有高滲透性,使得一定尺寸、大小和分子量的顆粒物具有非特異靶向性,這種非特異性的腫瘤富集現(xiàn)象稱為EPR效應(yīng)(enhanced permeablity retention effect,EPR)[6]。因此通過(guò)納米顆粒運(yùn)載特定藥物或基因,可具備一定的腫瘤靶向性。另外,通過(guò)將一些傳統(tǒng)藥物加以改造制成納米顆?？梢赃_(dá)到優(yōu)化藥物特性的目的。比如將核苷類抗癌、抗腫瘤藥物連接到角鯊烯上,可以聚集成100～300 nm的納米顆粒,這將提高藥物的藥效和穩(wěn)定性,降低腫瘤的抗藥性[7-8]。

利用天然陽(yáng)離子多糖(殼聚糖)運(yùn)載DNA,因其與帶負(fù)電荷的核酸分子結(jié)合作用很強(qiáng),體內(nèi)使用具有很好的生物降解性、生物相容性,較低的細(xì)胞毒性,價(jià)格也很低廉[9-10]。另一方面,殼聚糖納米顆粒運(yùn)送DNA,可能存在胞漿內(nèi)DNA釋放遲緩、不能逃離細(xì)胞內(nèi)體(溶酶體)酶的作用,被降解而不能表達(dá)出目的產(chǎn)物的現(xiàn)象[11-12]。高分子量殼聚糖在生理pH狀態(tài)下容易聚集、黏稠度高而丟失在體內(nèi)運(yùn)送基因疫苗的可能性[13-14]。本研究中對(duì)殼聚糖進(jìn)行羥丙基三甲基氯化銨修飾,使該材料在生理pH狀態(tài)下仍然保持很好的水溶性。另外,盡管我們制備的殼聚糖納米顆粒可被細(xì)胞攝取,但低于陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)相同質(zhì)量DNA轉(zhuǎn)染后的表達(dá)效率,提示可進(jìn)一步改善納米顆粒制備條件,以獲得更好的細(xì)胞攝取率[15]。

綜上所述,本研究基于自行制備的羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖材料,成功制備負(fù)載pcDNA 3.1-EGFP表達(dá)載體的納米顆粒。其大小在100～300 nm,攜帶正電荷,被細(xì)胞有效攝取而表達(dá)出綠色熒光蛋白,并具有很好的生物安全性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)制備負(fù)載pcDNA3.1系列重組載體的納米顆粒,體內(nèi)運(yùn)送基因疫苗而治療腫瘤,提供了重要的參考依據(jù)。

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