NF1基因新突變及我國(guó)首例NF1基因拷貝數(shù)目變異報(bào)道*

鄧 佳， 鄧偉平， 鐘 誠(chéng)， 胡 彬， 王一鳴△

1型神經(jīng)纖維瘤(type 1 neurofibromatosis)是最常見(jiàn)的常染色體顯性遺傳病之一，在人群中的發(fā)病率為1/2 500～1/3 000［1］。主要臨床表現(xiàn)為皮膚及皮下神經(jīng)纖維瘤、咖啡斑和虹膜錯(cuò)構(gòu)瘤(Lisch結(jié)節(jié))。部分患者可具有面容異常及智力低下［2-3］或并發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)瘤［4-5］、惡性周?chē)窠?jīng)鞘瘤等［6］。神經(jīng)纖維瘤1(neurofibromatosis 1，NF1;MIM ID:613113)基因是本病的致病基因，定位于染色體17q11.2，含58個(gè)編碼外顯子，有3種剪接方式，其最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄亞型編碼2 839個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，外顯率接近100%?，F(xiàn)已報(bào)道的NF1基因突變類(lèi)型呈多樣化，堿基置換、剪切位點(diǎn)突變、小片段的插入和缺失、大片段的缺失、插入及重復(fù)、復(fù)雜的重排、拷貝數(shù)目變異等均有報(bào)道，其中關(guān)于拷貝數(shù)目變異的報(bào)道僅限于非中國(guó)人群，我國(guó)尚未見(jiàn)這一變異的報(bào)道。約50%的病例為自發(fā)突變所致［7］，是人類(lèi)基因中突變率最高的基因之一。

近年來(lái)隨著新一代測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，對(duì)每一例腫瘤病人進(jìn)行測(cè)序，獲得其致病性突變，從而進(jìn)行個(gè)體化治療［8］，這已成為部分西方國(guó)家的腫瘤研究/治療途徑。本研究中，我們對(duì)2例病人的NF1基因進(jìn)行分析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)一例國(guó)際上未報(bào)道的新突變，并首次在國(guó)內(nèi)報(bào)道了另一例患者NF1基因的拷貝數(shù)目變異。

材料和方法

1 研究對(duì)象

2例1型神經(jīng)纖維瘤的病人均來(lái)自于廣東省人民醫(yī)院皮膚科，他們的父母及50例正常對(duì)照的血樣也來(lái)自于廣東省人民醫(yī)院。本研究得到了研究對(duì)象及患者家屬的知情同意和中山大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

患者S736出生時(shí)即發(fā)現(xiàn)軀干、四肢有散發(fā)的咖啡斑。5歲開(kāi)始腹部出現(xiàn)散在的皮膚或皮下神經(jīng)纖維瘤。大小不一，指壓瘤體似海綿狀并呈局部凹陷，松開(kāi)手指即恢復(fù)原狀，同時(shí)伴有色素沉著斑，但一直無(wú)自覺(jué)癥狀。隨著年齡增長(zhǎng)，皮損波及軀干四肢。患者的智力、身體發(fā)育均正常，不伴有眼睛及周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)癥狀。另一患者S743出生時(shí)即出現(xiàn)了與患者S736相似的皮膚表現(xiàn)，此外還于幼年期出現(xiàn)了腰椎右側(cè)彎曲，認(rèn)知能力較差，以致不能完成初中學(xué)業(yè)并最后綴學(xué)，患者于19歲死于腦膠質(zhì)瘤。按NIH標(biāo)準(zhǔn)［9］，兩患者均診斷為1型神經(jīng)纖維瘤，兩患者的父母經(jīng)詳細(xì)的臨床檢查未發(fā)現(xiàn)異常。

2 方法

2.1 基因組DNA提取 抽取患者及其父母和50例正常對(duì)照外周血2 mL，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝，按 Qiagen 基因組小量抽提試劑盒指南提取DNA。

2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR 從數(shù)據(jù)庫(kù)UCSC Human Genome Browser(http://genome.ucsc.edu)(GRCh37/hg19)提取NF1基因的序列 (NG_009018.1)，利用Oligo 6.0(http://www.oligo.net/downloads.html)自行設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增基因編碼區(qū)域及剪切位點(diǎn)的引物，并由上海生工生物公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為30μL標(biāo)準(zhǔn)體系，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;95℃30 s，退火 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。

2.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序及突變鑒定 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，所用試劑為Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)，在 ABI 3730XL DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行。對(duì)測(cè)序結(jié)果用Sequence Scanner 1.0軟件(ABI)分析，所得序列與UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。堿基變異按den Dunnen以及Antonarakis(http://www.hgvs.org/mutnomen/)命 名 法則［10］。對(duì)所發(fā)現(xiàn)的遺傳變異與人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(the Human Gene Mutation Database，HGMD;http://www.hgmd.org/)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，并查詢(xún)PubMed上已發(fā)表的文獻(xiàn)確定所檢突變是否為新突變。突變根據(jù)以下參考序列命名:GenBank NM_001042492.2 和 GenBank NP_001035957.1。

2.4 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù) 在測(cè)序中對(duì)于未發(fā)現(xiàn)突變的患者S743，我們推測(cè)為NF1拷貝數(shù)目改變所致，故進(jìn)一步采用了多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)進(jìn)行分析。為了排除多重突變的情況，我們對(duì)已發(fā)現(xiàn)突變的病人S736也進(jìn)行了此分析。MLPA 1型神經(jīng)纖維瘤檢測(cè)試劑盒購(gòu)自MRC-Holland，外顯子區(qū)域及邊界區(qū)域探針包含在以下3組探針盒中:SALSA P081、P082和P122。實(shí)驗(yàn)流程按MDA-002版本MLPA說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，產(chǎn)物經(jīng)ABI 3730XL DNA自動(dòng)測(cè)序儀電泳后，對(duì)獲得的GeneMapper數(shù)據(jù)用Coffalyser軟件進(jìn)行分析。

2.5 長(zhǎng)片段PCR 由于MLPA實(shí)驗(yàn)提示患者S743存在NF1基因的大片段缺失，我們根據(jù)MLPA檢測(cè)的結(jié)果，結(jié)合國(guó)際上已報(bào)道的NF1 3個(gè)常見(jiàn)缺失片段的斷裂部分，合成了長(zhǎng)片段PCR引物(表1)，并進(jìn)行相應(yīng)的PCR反應(yīng)。

表1 檢測(cè)斷裂點(diǎn)的長(zhǎng)片段PCR引物序列Table 1.Primers used for the long range PCR to detect the breakpoint

結(jié) 果

1 突變檢測(cè)結(jié)果

正反向測(cè)序證實(shí)病人S736在NF1基因中存在1 個(gè)新突變:c.6345_6346 ins G(p.Leu2116Alafs*4)，見(jiàn)圖1A。該突變?cè)斐砷_(kāi)放閱讀框架的移位，在肽鏈第2 119位引入終止密碼子，從而使3’端721個(gè)氨基酸被截?cái)啵瑏G失了野生型蛋白中犰狳式褶皺(ARM-type fold)結(jié)構(gòu)域C末端的一部分(InterPro，http://www.ebi.ac.uk/interpro/)，見(jiàn)圖 2。SIFT 預(yù)測(cè)，此突變還可引起無(wú)義突變介導(dǎo)的mRNA降解(nonsense mediated decay，NMD)，導(dǎo)致含該突變的等位基因無(wú)實(shí)際上的表達(dá)。此突變經(jīng)3次以上正反向驗(yàn)證。HGMD檢索并未發(fā)現(xiàn)此突變的報(bào)道，故為一新突變，50例無(wú)血緣關(guān)系的正常人中未發(fā)現(xiàn)同樣突變。獲此結(jié)果后，我們進(jìn)一步對(duì)其父母進(jìn)行這一突變的檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)異常，見(jiàn)圖1B、C，故此突變?yōu)橐籨e novo突變。病人S743在NF1基因的編碼外顯子及其側(cè)翼序列未發(fā)現(xiàn)突變。

Figure 1.Partial sequencing results of patient S736(A)and her parents(B，C).Arrows indicate the insertion of G in patient S736 and the wild C in her parents.圖1 患者S736及其父母的部分測(cè)序圖結(jié)果

2 MLPA結(jié)果

病人S743 MLPA檢測(cè)結(jié)果提示1.3～1.9 Mb缺失(圖3)，缺失片段涵蓋整個(gè)NF1基因及其部分5’和3’端的側(cè)翼部分。病人S736 MLPA檢測(cè)未見(jiàn)異常。

Figure 2.Mutant NF1 protein of patient S736.The wild-type NF1 protein has an armadillo(ARM)-type fold domain(green)and two domains:Ras-GAP(red)，CRALTRIO(blue).Arrow denotes the truncating point of the mutation p.Leu2116Alafs*4，which would result in the loss of part of the ARM-type fold.圖2 患者S736的突變NF1蛋白

Figure 3.The MLPA results showed a 1.3 ～1.9 Mb deletion in patient S743.A:patient S743.Probes with* (red)show the heterozygous deletion positions.B:normal control.圖3 患者S743的MLPA結(jié)果顯示有1.3～1.9 Mb缺失

3 長(zhǎng)片段PCR

長(zhǎng)片段PCR未獲得任何特異性擴(kuò)增片段，提示這一病例的缺失可能存在不同于以往報(bào)道的斷裂點(diǎn)。

討 論

本研究先對(duì)2例1型神經(jīng)纖維瘤患者進(jìn)行了NF1基因的突變篩查。通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的方法，在患者S736中發(fā)現(xiàn)了NF1基因新生突變c.6345_6346 ins G(p.Leu2116Alafs*4)，HGMD 檢索證明該突變?yōu)橐粋€(gè)新突變。此后，對(duì)2個(gè)病人進(jìn)行了MLPA檢測(cè)，病人S743檢測(cè)到整個(gè)NF1基因的缺失和5’和3’端側(cè)翼序列的缺失，且缺失區(qū)域在1.3～1.9 Mb范圍內(nèi)，文獻(xiàn)檢索證明這是國(guó)內(nèi)第一次用MLPA對(duì)NF1基因進(jìn)行檢測(cè)，也是首次中國(guó)人整個(gè)NF1基因缺失的報(bào)道。

p.Leu2116Alafs*4使NF1蛋白的第2 116位氨基酸由亮氨酸變成丙氨酸，并且由于堿基的插入導(dǎo)致了密碼子的框移，在突變位點(diǎn)后的第3個(gè)密碼子處出現(xiàn)終止密碼子從而使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)截?cái)?，p.Leu2116Alafs*4位于 ARM-type fold結(jié)構(gòu)域。ARM-type fold是一個(gè)多超螺旋褶皺，由2弧層α螺旋排列在一個(gè)常規(guī)的右手超螺旋中，這種結(jié)構(gòu)提供了一個(gè)廣泛的溶劑表面，很適合與底物如蛋白質(zhì)和核酸結(jié)合。p.Leu2116Alafs*4突變截?cái)嗔艘吧偷鞍踪|(zhì)中的部分ARM-type fold結(jié)構(gòu)域(圖2)，可能影響它的超螺旋結(jié)構(gòu)從而影響NF1蛋白與DNA或蛋白質(zhì)的結(jié)合及相互作用，最終導(dǎo)致功能的喪失;且由于無(wú)義突變介導(dǎo)的mRNA降解，此突變不存在轉(zhuǎn)錄蛋白，相當(dāng)于等位基因缺失。該患者父母體格檢查正常，皮膚黏膜未發(fā)現(xiàn)異常，且突變篩查結(jié)果陰性，說(shuō)明該患者的突變是de novo突變，50例正常對(duì)照的篩查也排除了多態(tài)性的可能，因此本研究所發(fā)現(xiàn)的NF1 de novo突變是引起1型神經(jīng)纖維瘤的致病性突變。

1型神經(jīng)纖維瘤病人中，約5%［11］病人存在大片段的NF1基因缺失?；颊逽743經(jīng)MLPA檢測(cè)提示其存在含整個(gè)NF1基因的一段1.3～1.9 Mb的缺失，非等位基因同源重組被認(rèn)為是導(dǎo)致大片段缺失發(fā)生的最常見(jiàn)原因，國(guó)外研究已發(fā)現(xiàn)3個(gè)重組熱點(diǎn):1.4 Mb的缺失稱(chēng)為1型，是大片段缺失最常見(jiàn)的一型，斷裂點(diǎn)主要位于 NF1-REPs A 和 C［12-13］;1.2 Mb的缺失稱(chēng)為2型，斷裂點(diǎn)位于SUZ12和它的假基因SUZ12P 內(nèi)［14］;1.0 Mb的缺失稱(chēng)為3 型，斷裂點(diǎn)位于NF1-REPs B 和 C［3，15］。大片段的 NF1 缺失經(jīng)常與嚴(yán)重疾病表型相關(guān)，如先天性面部畸形、智力缺陷及對(duì)惡性腫瘤易感性高。S743患者于19歲患腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤而死亡，屬重型1型神經(jīng)纖維瘤患者，這顯然與它缺失NF1基因相關(guān)。NF1基因是一個(gè)腫瘤抑制基因，它能下調(diào)原癌基因ras的活性［16］。由于我們針對(duì)3個(gè)常見(jiàn)斷裂點(diǎn)的長(zhǎng)片段PCR未獲得陽(yáng)性結(jié)果，此患者可能含有新的不常見(jiàn)的斷裂點(diǎn)，目前我們對(duì)于S743患者的斷裂點(diǎn)研究仍在進(jìn)行中。

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