SFRP5基因甲基化通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞MDR1/P-gp的表達(dá)*

王慧涵， 胡 榮， 李迎春， 趙成海， 楊 威， 廖愛(ài)軍， 劉卓剛

分泌型卷曲相關(guān)蛋白5(secreted frizzled-related protein 5，SFRP5)是分泌型糖蛋白家族成員之一，結(jié)構(gòu)上與Wnt信號(hào)通路的特異性受體卷曲蛋白(Fz)受體極為相似，具有同源的配體抑制區(qū)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制Fz受體從而抑制 Wnt的活動(dòng)［1］。有研究顯示在白血病細(xì)胞中存在SFRP5基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化，導(dǎo)致SFRP5蛋白表達(dá)缺失或下調(diào)［2］，但這種SFRP5基因甲基化在白血病發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確。本文從白血病多藥耐藥的角度，研究SFRP5基因甲基化對(duì)白血病細(xì)胞多藥耐藥1(multidrug resistance 1，MDR1)基因及其編碼的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)表達(dá)的調(diào)節(jié)作用并探索其可能的信號(hào)通路。

材料和方法

1 材料

2011年6月至2011年12月，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液科診斷(WHO診斷標(biāo)準(zhǔn))的12例急性白血病患者(L1～L12)骨髓單個(gè)核細(xì)胞作為標(biāo)本。12例患者的疾病類(lèi)型為:急性淋巴細(xì)胞白血病2例(L1和 L9);急性髓系白血病 7 例(L3、L4、L6、L8、L10、L11和L12);慢性髓系白血病2例(L2和L5)。人白血病細(xì)胞系HL-60來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液科留存;人白血病細(xì)胞系KG1a來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所;人淋巴瘤白血病細(xì)胞系Raji和人白血病細(xì)胞系U937細(xì)胞來(lái)自上海復(fù)旦大學(xué)賈立軍教授惠贈(zèng)。

2 主要試劑

AxyPrep基因組DNA小量試劑盒及MethylCodeTMBisulfite Conversion Kit購(gòu)自Invitrogen;Zymo-TagTMDNA Polymerase及EZ DNA Methylation-Gold Kit購(gòu)自 Zymo Research;5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶(5-aza-2'-deoxycytidine，DAC)購(gòu)自 Sigma;SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒、Tag DNA聚合酶和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶均購(gòu)自TaKaRa;非磷酸化β-catenin(nonphosphorylated β-catenin，NP-β-catenin)單抗、β-actin單抗和P-gp單抗購(gòu)自Santa Cruz;引物由Invitrogen公司設(shè)計(jì)及合成，見(jiàn)表1。

3 主要方法

3.1 甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP) 用AxyPrep基因組DNA小量試劑盒提取基因組 DNA。用 MethylCodeTMBisulfite Conversion Kit試劑盒對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉處理。以處理后的DNA為模板，MSP檢測(cè)SFRP5基因甲基化。PCR擴(kuò)增體系20 μL:其中修飾后的 DNA 20 ng，10 μmol/L 上、下游引物各 0.4 μL，2 × Reaction Buffer 10 μL，dNTP Mix 0.2 μL，ZymoTagTMDNA Polymerase(5 ×106U/L)0.16 μL，滅菌 ddH2O 加至總體積20 μL。PCR擴(kuò)增條件:95℃ 10 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，40個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3.2 Western blotting 檢測(cè)非磷酸 化 β-catenin、SFRP5及P-gp蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞，PBS洗2遍，每107個(gè)細(xì)胞加1 mL預(yù)冷的RIPA裂解液，混勻，冰上振蕩30 min，4 ℃、12 000 r/min離心 30 min，收上清，BCA方法測(cè)蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品加入上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，用SDS-PAGE分離，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。將硝酸纖維素濾膜加入含有5%脫脂奶粉的封閉液中，4℃搖床孵育過(guò)夜，加入兔抗人非磷酸化β-catenin、兔抗人SFRP5及兔抗人P-gpⅠ抗，4℃搖床孵育過(guò)夜。除去Ⅰ抗，加入鼠抗兔Ⅱ抗，室溫下?lián)u床孵育2 h，除去Ⅱ抗。加顯色劑，在X射線膠片曝光成像并分析。

3.3 RT-PCR檢測(cè)MDR1 mRNA的表達(dá) 用Trizol提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR擴(kuò)增體系25 μL:10 × Buffer 2.5 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物(10 mmol/L)各 0.5 μL，Tag DNA 聚合酶 (5 × 106U/L)0.5 μL，滅菌ddH2O 19.5 μL。PCR 擴(kuò)增條件:94 ℃ 5 min;94 ℃1 min，55℃ 30 s，72℃ 50 s，共30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，分離目的條帶和內(nèi)參照。

3.4 Real-time PCR定量檢測(cè)DAC處理前后MDR1 mRNA的表達(dá) 應(yīng)用SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒。PCR擴(kuò)增體系20 μL:SYBR? Premix Ex TaqTM(2 × )10.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μL，ROX Reference Dye II(50 × )0.4 μL，cDNA 2.0 μL，滅菌 ddH2O 6.8 μL。PCR 擴(kuò)增條件:95 ℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 35 s，共40個(gè)循環(huán)。各組設(shè)立3個(gè)平行孔，反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)定閾值，軟件輸出CT值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析(ANOVA)，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SFRP5基因在白血病患者及白血病細(xì)胞系中的甲基化狀態(tài)

在12例白血病患者(L1～L12)標(biāo)本中有7例(L2、L4、L5、L6、L7、L8 和 L11)發(fā)生了 SFRP5 基因甲基化，其中L5和L6發(fā)生了SFRP5基因部分甲基化。4種白血病細(xì)胞系 HL-60、Raji、U937和 KG1a中SFRP5基因均發(fā)生甲基化，見(jiàn)圖1。

Figure 1.SFRP5 gene promoter region methylation status detected by MSP.A:12 cases of leukemic patients;B:4 cell lines of leukemia.M:methylated;U:unmethylated.圖1 MSP方法檢測(cè)12例白血病患者標(biāo)本及4種白血病細(xì)胞系中SFRP5基因甲基化狀態(tài)

2 非磷酸化β-catenin在SFRP5基因甲基化白血病患者及細(xì)胞系中的表達(dá)

由于SFRP5表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致 Wnt/β-catenin激活，我們檢測(cè)存在SFRP5基因完全甲基化的患者標(biāo)本(L2、L4、L7、L8和L11)及4種白血病細(xì)胞系中NP-β-catenin的表達(dá)狀態(tài)。檢測(cè)結(jié)果顯示在5例SFRP5完全甲基化的患者標(biāo)本中，有3例(L2、L7和L8)NP-β-catenin水平高于其它2例(P＜0.05)。在4種白血病細(xì)胞系中，KG1a細(xì)胞中NP-β-catenin水平明顯高于其它3種細(xì)胞(P＜0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. Non-phosphorylated β-catenin(NP-β-catenin)expression in leukemic patients(A)and cell lines(B)with methylated SFRP5 gene was detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.△△P ＜0.01 vs L4;#P ＜0.01 vs L11;＊＊P ＜0.01 vs KG1a.圖2 Western blotting檢測(cè)非磷酸化β-catenin在白血病患者標(biāo)本及細(xì)胞系中的表達(dá)

3 MDR1 mRNA在白血病患者及細(xì)胞系中的表達(dá)

采用RT-PCR檢測(cè)MDR1 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在白血病患者標(biāo)本中，存在NP-β-catenin高水平表達(dá)的3例患者(L2、L7和L8)檢出MDR1 mRNA表達(dá)。在4種細(xì)胞系中，KG1a細(xì)胞存在MDR1 mRNA表達(dá)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.MDR1 mRNA expression of leukemic patients and cell lines was detected by RT-PCR.A:12 cases of leukemic patients;B:4 cell lines of leukemia.圖3 RT-PCR檢測(cè)MDR1 mRNA在白血病患者和細(xì)胞系中的表達(dá)

4 P-gp在白血病患者及細(xì)胞系中的表達(dá)

Western blotting檢測(cè)P-gp結(jié)果與MDR1 mRNA一致，即只在NP-β-catenin高水平表達(dá)的3例患者(L2、L7和L8)中檢出P-gp表達(dá)。在4種細(xì)胞系中，KG1a細(xì)胞檢出P-gp表達(dá)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.P-gp expression of leukemic patients and cell lines was detected by Western blotting.A:12 cases of leukemic patients;B:4 cell lines of leukemia.圖4 Western blotting檢測(cè)P-gp在白血病患者和細(xì)胞系中的表達(dá)

5 去甲基化試劑處理后標(biāo)本和細(xì)胞系中MDR1/P-gp表達(dá)的變化

使用去甲基化試劑DAC 5 μmol/L處理P-gp陽(yáng)性標(biāo)本 L2、L7、L8 和 KG1a，處理時(shí)間 72 h，恢復(fù)SFRP5表達(dá)。Western blotting結(jié)果顯示P-gp表達(dá)水平在SFRP5表達(dá)恢復(fù)后被下調(diào)。進(jìn)一步使用realtime PCR檢測(cè)MDR1 mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示DAC處理后MDR1 mRNA水平均顯著下降(P＜0.01)，見(jiàn)圖5。

討 論

SFRP5是SFRPs家族的一個(gè)分泌型蛋白，大量的研究顯示在多種腫瘤細(xì)胞中存在SFRP5基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，并導(dǎo)致蛋白表達(dá)的下降［3-4］。但是SFRP5基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化及所引起的SFRP5蛋白表達(dá)缺失或下調(diào)在腫瘤中的作用尚不明確。

SFRP5作為 Wnt的抑制因子，主要通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路發(fā)揮作用。Wnt家族也屬于分泌型糖蛋白，是重要的細(xì)胞外信號(hào)分子家族。大量研究揭示W(wǎng)nt的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)［5-7］。經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活因子β-catenin激活下游靶基因發(fā)揮作用，相關(guān)的靶基因有c-myc、CCND1、MMP-7和WISPI等，這些基因參與腫瘤的形成及發(fā)展［8-10］。Lim等［11］應(yīng)用大鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞及人大腦內(nèi)皮細(xì)胞系hCMEC/D3作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用GSK-3抑制劑激活β-catenin通路能夠促進(jìn)MDR1基因轉(zhuǎn)錄及P-gp蛋白表達(dá)，并伴隨藥物外排的增加。Flahaut等［12］報(bào)道了21例神經(jīng)母細(xì)胞瘤的患者化療后存在FZD1及MDR1的過(guò)表達(dá)。應(yīng)用specific micro-adaptedshorthairpinRNA(shRNAmir)介導(dǎo)的FZD1基因沉默后，MDR1表達(dá)明顯減少。這兩項(xiàng)研究將Wnt/β-catenin信號(hào)通路與腫瘤的多藥耐藥聯(lián)系在了一起，證明MDR1是β-catenin的又一個(gè)下游靶基因。但是關(guān)于Wnt的抑制因子SFRPs家族成員與MDR的關(guān)系尚無(wú)研究。

Figure 5.Effects of SFRP5 expression recovery by demethylation reagent DAC(5 μmol/L，72 h)on MDR1 mRNA and P-gp protein expression in P-gp positive specimens.A:SFRP5 expression detected by Western blotting;B:P-gp expression detected by Western blotting;C:MDR1 mRNA expression detected by real-time PCR.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs DAC(－).圖5 DAC對(duì)P-gp陽(yáng)性標(biāo)本和細(xì)胞系中MDR1/P-gp表達(dá)的影響

Griffiths等［2］的研究提示SFRP5甲基化導(dǎo)致的SFRP5蛋白表達(dá)下降可能增加急性髓系白血病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。Su等［13］研究卵巢癌發(fā)現(xiàn)SFRP5甲基化狀態(tài)與卵巢癌對(duì)順鉑的耐藥有關(guān)，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染恢復(fù)SFRP5表達(dá)后減弱Wnt信號(hào)通路，能夠抑制小鼠卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及腫瘤形成。同時(shí)SFRP5恢復(fù)表達(dá)還能夠抑制上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，恢復(fù) SFRP5表達(dá)能夠下調(diào)Akt2，增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性。這些研究提示了SFRP5在腫瘤復(fù)發(fā)及耐藥中可能發(fā)揮作用。

為了驗(yàn)證SFRP5基因甲基化是否參與形成白血病MDR及其可能的信號(hào)通路，我們首先檢測(cè)了SFRP5甲基化的5例患者標(biāo)本及4種白血病細(xì)胞系中β-catenin的活化形式——NP-β-catenin的表達(dá)狀態(tài)，結(jié)果顯示有3例患者標(biāo)本的NP-β-catenin水平高于其他2例。在4種白血病細(xì)胞系中，KG1a細(xì)胞中NP-β-catenin水平明顯高于其它3種細(xì)胞系。接著發(fā)現(xiàn)存在NP-β-catenin高水平表達(dá)的3例患者檢出MDR1 mRNA表達(dá)。在4種細(xì)胞系中，KG1a細(xì)胞存在MDR1 mRNA表達(dá)。蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果與mRNA水平一致，即只在NP-β-catenin高水平表達(dá)的標(biāo)本中檢出P-gp表達(dá)。這個(gè)結(jié)果初步驗(yàn)證了MDR1是β-catenin的下游靶基因，隨著β-catenin的激活而轉(zhuǎn)錄增加。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)結(jié)果，我們使用去甲基化試劑 DAC處理 P-gp陽(yáng)性標(biāo)本 L2、L7、L8和KG1a，以恢復(fù)SFRP5表達(dá)。結(jié)果顯示在SFRP5表達(dá)恢復(fù)后P-gp表達(dá)水平被下調(diào)，MDR1 mRNA水平均亦顯著下降(P＜0.01)。

因此我們認(rèn)為，SFRP5基因甲基化導(dǎo)致蛋白表達(dá)缺失對(duì)Wnt的抑制作用減弱，引起Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活，β-catenin下游靶基因MDR1轉(zhuǎn)錄增加，編碼的藥物外排泵P-gp表達(dá)增加，參與腫瘤多藥耐藥的形成。當(dāng)然，SFRP5基因在某些白血病細(xì)胞中存在非甲基化狀態(tài)，這些細(xì)胞的耐藥性是否有所不同尚需進(jìn)一步研究。本文的結(jié)論進(jìn)一步完善了白血病細(xì)胞中SFRP5基因甲基化參與腫瘤形成發(fā)展的機(jī)制，并使SFRP5及其信號(hào)通路可能作為評(píng)估白血病預(yù)后的新指標(biāo)及治療多藥耐藥白血病的新靶點(diǎn)。

［1］ Mii Y，Taira M.Secreted Wnt“inhibitors”are not just inhibitors:regulation of extracellular Wnt by secreted Frizzled-related proteins［J］.Dev Growth Differ，2011，53(8):911-923.

［2］ Griffiths EA，Gore SD，Hooker C，et al.Acute myeloid leukemia is characterized by Wnt pathway inhibitor promoter hypermethylation［J］.Leuk Lymphoma，2010，51(9):1711-1719.

［3］ Shin H，Kim JH，Lee YS，et al.Change in gene expression profiles of secreted frizzled-related proteins(SFRPs)by sodium butyrate in gastric cancers:Induction of promoter demethylation and histone modification causing inhibition of Wnt signaling［J］.Int J Oncol，2012，40(5):1533-1542.

［4］ 郭艷麗，郭 煒，鄺 鋼，等.食管鱗狀細(xì)胞癌中SFRP基因家族啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的檢測(cè)［J］.中國(guó)病理生理雜志，2011，27(2):278-283.

［5］ Yao H，Ashihara E，Maekawa T.Targeting the Wnt/βcatenin signaling pathway in human cancers［J］.Expert Opin Ther Targets，2011，15(7):873-887.

［6］ Wang Y，van der Zee M，F(xiàn)odde R，et al.Wnt/β-catenin and sex hormone signaling in endometrial homeostasis and cancer［J］.Oncotarget，2010，1(7):674-684.

［7］ Verkaar F，Zaman GJ.New avenues to target Wnt/β-catenin signaling［J］.Drug Discov Today，2011，16(1-2):35-41.

［8］ Amado NG，F(xiàn)onseca BF，Cerqueira DM，et al.Flavonoids:potential Wnt/β-catenin signaling modulators in cancer［J］.Life Sci，2011，89(15-16):545-554.

［9］ El Wakil A，Lalli E.The Wnt/β-catenin pathway in adrenocortical development and cancer［J］.Mol Cell Endocrinol，2011，332(1-2):32-37.

［10］ 李海英，張 力，潘歡樂(lè)，等.Wnt信號(hào)通路在食管癌細(xì)胞放射抗拒性形成中的作用［J］.中國(guó)病理生理雜志，2012，28(9):1623-1326.

［11］ Lim JC，Kania KD，Wijesuriya H，et al.Activation of βcatenin signalling by GSK-3 inhibition increases P-glycoprotein expression in brain endothelial cells［J］.J Neurochem，2008，106(4):1855-1865.

［12］ Flahaut M，Meier R，Coulon A，et al.The Wnt receptor FZD1 mediates chemoresistance in neuroblastoma through activation of the Wnt/β-catenin pathway［J］.Oncogene，2009，28(23):2245-2256.

［13］ Su HY，Lai HC，Lin YW，et al.Epigenetic silencing of SFRP5 is related to malignant phenotype and chemoresistance of ovarian cancer through Wnt signaling pathway［J］.Int J Cancer，2010，127(3):555-567.