肺炎衣原體感染通過PI3K激活Rac1而誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞遷移*

張俊霞， 張騰騰， 張利軍， 王蓓蓓， 魏俊燕， 王海偉， 沈炳玲， 張麗莙

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)引發(fā)的心腦血管疾病是目前人類死亡的首要原因，嚴(yán)重威脅人類健康。自Ross提出“AS是一種慢性炎癥性疾病”［1］以來，感染性因素，尤其是肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae，C.pn)感染與AS的關(guān)系倍受關(guān)注［2-3］。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)由動脈壁中膜向內(nèi)膜遷移是AS發(fā)病過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。研究表明，C.pn感染可以通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞遷移［4-5］。Rac1是小G蛋白Rho家族成員，其通過GTP結(jié)合的有活性形式和GDP結(jié)合的無活性形式循環(huán)調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在肌動蛋白細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用［6-7］。磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是具有催化活性的胞內(nèi)信號蛋白，在細(xì)胞遷移等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用［8-9］，且與Rac1關(guān)系密切［10］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)C.pn感染通過激活PI3K及其信號途徑促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、VSMCs遷移［11-12］。C.pn感染是否能誘導(dǎo)VSMCs內(nèi)Rac1活化并通過其調(diào)控VSMCs遷移，以及在此過程中PI3K是否對Rac1的活化發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，目前尚不清楚。本研究以Rac1為著眼點(diǎn)，采用GST-pull down實(shí)驗(yàn)觀察C.pn感染VSMCs后Rac1活性的變化，并使用PI3K特異性抑制劑進(jìn)一步探討PI3K對C.pn感染誘導(dǎo)VSMCs內(nèi)Rac1活化的調(diào)節(jié)作用，為闡明C.pn感染誘導(dǎo)VSMCs遷移的相關(guān)分子機(jī)制及有效防治AS提供新思路。

材料和方法

1 材料

SD大鼠主動脈原代VSMCs為本課題組分離、培養(yǎng)并鑒定［13］;C.pn AR-39 株 (美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫，ATCC53592);DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS;Gibco);DEAE(Sigma);Glutathione Sepharose 4B(GE Heathcare);GST-PBD重組質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存;感受態(tài)細(xì)菌E.coli BL21(北京全式金生物技術(shù)有限公司);異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)(Prommega);小鼠抗大鼠 Rac1抗體(BD);小鼠抗大鼠βactin抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(Jackson);Rac1抑制劑NSC23766(Merck);PI3K抑制劑LY294002(Prommega);BCA蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所);ECL發(fā)光液(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所);蛋白酶抑制劑(Thermo);羥基脲(Sigma);Transwell小室(Corning)。

2 方法

2.1 VSMCs的培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 VSMCs用含10%FBS的DMEM在37℃、5%CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長至90%單層融合后，0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代，選擇生長良好的3～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組如下:正常對照組、C.pn感染組、NSC23766組、NSC23766 +C.pn感染組、LY294002組和LY294002 + C.pn感染組。NSC23766組和NSC23766 + C.pn感染組、LY294002組 和LY294002+C.pn感染組的 VSMCs分別用 50 μmol/L NSC23766、25 μmol/L LY294002 37 ℃孵育1 h進(jìn)行預(yù)處理。同時，遷移實(shí)驗(yàn)中使用羥基脲0.8 mmol/L預(yù)處理細(xì)胞12 h，消除細(xì)胞增殖對遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.2 GST-PBD融合蛋白的表達(dá)及純化 用成功構(gòu)建的GST-PBD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coli BL21，按1∶1 000的比例接種于5 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期(600 nm吸光度值為0.4～0.6)。挑取對數(shù)期細(xì)菌，按照1∶5 000的比例接種入100 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。次日加入IPTG(0.1 mmol/L)，28℃、130 r/min誘導(dǎo)蛋白表達(dá)3 h。4℃2 800 r/min離心30 min收集菌體，細(xì)菌裂解液(1%Triton X-100，1×PBS)重懸菌體沉淀，超聲裂解。4℃、13 000 r/min離心10 min，取上清，每1 mL上清液加入50 μL Glutathione Sepharose 4B，4℃ 孵育過夜，1×PBS洗滌4次，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 GST-pull down實(shí)驗(yàn)檢測VSMCs Rac1的活性

按照王蓓蓓等［13］的方法，在HEp-2細(xì)胞中增殖培養(yǎng)C.pn并感染VSMCs。感染24 h后，用含蛋白酶抑制劑的裂解液于冰上裂解細(xì)胞30 min，細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取1.0 mg相應(yīng)體積的蛋白樣品與孵育后的Glutathione Sepharose 4B混合，4℃過夜。次日4℃、1 000 r/min離心5 min，同樣條件洗滌4次，微量加樣器吸干EP管內(nèi)剩余液體，加入40 μL 1×上樣緩沖液，煮沸10 min。隨后，行12%SDS-PAGE并轉(zhuǎn)印于PVDF膜。特異性抗體孵育檢測目標(biāo)蛋白，ECL發(fā)光液顯影、定影后拍照，并用ImageJ軟件進(jìn)行條帶灰度分析。

2.4 Wound-healing實(shí)驗(yàn) 將VSMCs接種至6孔板，90%融合后，同步化處理12 h，加入0.8 mmol/L羥基脲作用12 h，用無菌移液管尖在培養(yǎng)板單層細(xì)胞的相同位置劃直線，造成“傷口”，PBS洗去脫落細(xì)胞。NSC23766預(yù)處理VSMCs 1 h后，接種感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為0.5 的 C.pn 并孵育24 h，顯微鏡下觀察VSMCs從劃痕處向中央爬行的面積，其面積大小表示VSMCs遷移能力強(qiáng)弱，每孔隨機(jī)取6個視野進(jìn)行觀察并拍攝，應(yīng)用圖像分析軟件ImageJ測量細(xì)胞遷移面積，計算平均值，行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

2.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 將 VSMCs接種至6孔板，90%融合后，同步化處理12 h，加入0.8 mmol/L羥基脲作用12 h，NSC23766預(yù)處理VSMCs 1 h后，將MOI為0.5的C.pn懸液接種于VSMCs，感染16 h后制備細(xì)胞濃度為1.5×108/L的VSMCs懸液，取100 μL細(xì)胞懸液加入 Transwell上室中，下室加入含50%FBS的DMEM，8 h后室溫下甲醇固定，結(jié)晶紫染色。倒置相差顯微鏡下每個小室隨機(jī)選取6個視野進(jìn)行拍攝，記錄每個視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值，行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，3組以上樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 GST-PBD融合蛋白的誘導(dǎo)與純化

使用GST-PBD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coli BL21，LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，并通過IPTG誘導(dǎo)GST-PBD融合蛋白的表達(dá)，隨后用Glutathione Sepharose 4B富集純化。為了保證GST-PBD與GTP-Rac1的特異性結(jié)合，純化表達(dá)GST-PBD蛋白的同時表達(dá)GST空載體。為鑒定并檢測純化蛋白的質(zhì)量及濃度，將純化得到的GST和GST-PBD蛋白經(jīng)SDS-PAGE后考馬斯亮藍(lán)染色，見圖1，純化得到的融合蛋白分子量正確，且濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

Figure 1.The purification of glutathione S-transferase(GST)-p21-binding domain of p21-activated kinase 1(PBD)(GST-PBD)fusion protein.M:protein marker;1:GST vector;2:GST-PBD fusion protein圖1 純化的GST-PBD融合蛋白

2 C.pn感染VSMCs前后Rac1活性的變化

VSMCs經(jīng)C.pn感染24 h后提取總蛋白，并與經(jīng)過鑒定達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的純化融合蛋白孵育，GST-pull down實(shí)驗(yàn)檢測C.pn感染前后GTP-Rac1變化;同時以GST空載體作為陰性對照。結(jié)果顯示，C.pn感染組GTP-Rac1表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.05)，且GST-PBD融合蛋白與GTP-Rac1特異性結(jié)合，此結(jié)果可真實(shí)反映細(xì)胞內(nèi)Rac1的活化水平，見圖2。

Figure 2.The C.pn infection-induced Rac1 activation detected by GST-pull down assay.1:control group;2:C.pn infection group;3:GST incubation with cell lyses.Mean ± SD.n=4.*P ＜0.05 vs control group.圖2 C.pn感染誘導(dǎo)VSMCs Rac1的活化

3 C.pn感染誘導(dǎo)PI3K依賴的Rac1活性上調(diào)

我們前期研究結(jié)果顯示PI3K/Akt在C.pn感染誘導(dǎo)的VSMCs遷移中發(fā)揮重要作用［11］。為證實(shí)PI3K在C.pn感染誘導(dǎo)的VSMCs Rac1活化中的作用，我們使用LY294002預(yù)處理VSMCs，進(jìn)而采用GST-pull down實(shí)驗(yàn)檢測GTP-Rac1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，LY294002+C.pn感染組GTP-Rac1表達(dá)明顯低于 C.pn感染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。各組之間總Rac1的表達(dá)量無明顯差別，見圖3。

4 Rac1活化在C.pn感染誘導(dǎo)的VSMCs遷移中的作用

C.pn感染 VSMCs 24 h后，wound-healing實(shí)驗(yàn)中，C.pn感染組VSMCs向劃痕中央遷移的面積明顯大于正常對照組(P＜0.05)，NSC23766預(yù)處理后VSMCs的Rac1活性被抑制，NSC23766+C.pn感染組VSMCs向劃痕中央遷移的面積顯著小于C.pn感染組(P ＜0.05)，見圖 4;Transwell實(shí)驗(yàn)中，C.pn感染組穿膜的VSMCs數(shù)明顯高于正常對照組(P＜0.05)，而 NSC23766+C.pn 感染組 VSMCs的穿膜數(shù)明顯低于 C.pn感染組(P ＜0.05)，見圖5。

Figure 3.The role of PI3K in Rac1 activation in C.pn-infected VSMCs detected by GST-pull down assay.1:control group;2:C.pn infection group;3:LY294002 group;4:LY294002+C.pn infection group.Mean ±SD.n=4.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs C.pn infection group.圖3 PI3K在C.pn感染誘導(dǎo)的VSMCs Rac1活化中的作用

Figure 4.The role of Rac1 activation in C.pn infection-induced migration of VSMCs detected by wound-healing assay.1:control group;2:C.pn infection group;3:NSC23766 group;4:NSC23766+C.pn infection group.Mean ± SD.n=6.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs C.pn infection group.圖4 Wound-healing實(shí)驗(yàn)檢測Rac1在C.pn感染誘導(dǎo)VSMCs遷移中的作用

Figure 5.The role of Rac1 activation in C.pn infection-induced migration of VSMCs detected by Transwell assay.1:control group;2:C.pn infection group;3:NSC23766 group;4:NSC23766+C.pn infection group.Mean ± SD.n=6.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs C.pn infection group.圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測Rac1在C.pn感染誘導(dǎo)VSMCs遷移中的作用

討 論

近年來，C.pn感染作為AS新的危險因素日益受到關(guān)注。C.pn是一種嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生菌，經(jīng)呼吸道侵入機(jī)體后感染其寄居部位(肺泡)的單核細(xì)胞［14］并以單核-巨噬細(xì)胞為載體經(jīng)血行遷移至動脈壁，可感染內(nèi)皮細(xì)胞、VSMCs及巨噬細(xì)胞等AS相關(guān)細(xì)胞［15］，參與AS的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期已成功建立C.pn感染內(nèi)皮細(xì)胞、VSMCs的模型，為進(jìn)一步研究其致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。VSMCs由血管壁中膜遷向內(nèi)膜在AS形成及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。研究表明，C.pn感染可通過炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的釋放影響細(xì)胞遷移［4-5］。但是，C.pn感染 VSMCs后是否能通過增強(qiáng)VSMCs的內(nèi)在動力系統(tǒng)來促進(jìn)其遷移，目前鮮有報道。

細(xì)胞遷移與免疫監(jiān)視、傷口愈合、AS、炎癥反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生理、病理過程相關(guān)，是一個緊密協(xié)調(diào)的過程。其中，“l(fā)eading edge”處的質(zhì)膜突起或片狀偽足的延伸是細(xì)胞遷移的主要驅(qū)動力。研究表明，片狀偽足的形成是由Rac1介導(dǎo)的［6-7］。C.pn感染又與Rac1關(guān)系密切，C.pn感染的單核細(xì)胞GTPRac1表達(dá)增加［16］。那么，C.pn感染 VSMCs后能否引起Rac1的活性變化，目前尚不清楚。為此，我們使用成功構(gòu)建的GST-PBD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，擴(kuò)增并誘導(dǎo)表達(dá)GST-PBD融合蛋白，特異性地與GTPRac1結(jié)合以檢測細(xì)胞內(nèi)Rac1的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C.pn感染后VSMCs Rac1的活性明顯高于正常對照組。Gou?ffic等［17］研究顯示透明質(zhì)酸可通過激活Rac1誘導(dǎo)VSMCs片狀偽足形成進(jìn)而促使細(xì)胞遷移。為了明確Rac1的活化在C.pn感染誘導(dǎo)的VSMCs遷移中的作用，我們使用 Rac1特異性抑制劑NSC23766(50 μmol/L)預(yù)處理 VSMCs，采用 woundhealing實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察VSMCs遷移能力的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，預(yù)處理組C.pn感染誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力明顯低于單純C.pn感染組。Rac1抑制劑NSC23766通過與Rac1的鳥嘌呤核苷酸交換因子Trio和Tiom相互作用干擾Rac1的磷酸化，并不影響Rac1的表達(dá)水平。相關(guān)文獻(xiàn)［18］及我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NSC23766(50 μmol/L)預(yù)處理可有效抑制Rac1的活化。這提示C.pn感染可能通過激活Rac1促進(jìn)VSMCs遷移。

Rac1作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的分子開關(guān)，通過與GTP/GDP結(jié)合形式之間的轉(zhuǎn)換，接受外部刺激并作用于細(xì)胞骨架或其靶蛋白，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［7］。PI3K作為具有催化活性的胞內(nèi)信號蛋白，在多種類型細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮調(diào)控作用［8-9］。文獻(xiàn)［16］報道，透明質(zhì)酸誘導(dǎo)的Rac1活化依賴PI3K的活性。PI3K-Rac1信號通路在IL-8引起的內(nèi)皮細(xì)胞遷移中也發(fā)揮重要作用［19］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt在C.pn感染誘導(dǎo)的 VSMCs遷移中發(fā)揮重要作用［11］，PI3K 抑制劑 LY294002(25 μmol/L)可有效抑制C.pn感染誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。為進(jìn)一步探討C.pn感染的VSMCs中PI3K對Rac1活化的影響，我們使用LY294002預(yù)處理VSMCs，GST-pull down實(shí)驗(yàn)檢測Rac1活性的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與C.pn感染組相比，預(yù)處理組VSMCs GTP-Rac1表達(dá)明顯降低，這提示在C.pn感染誘導(dǎo)的VSMCs遷移中Rac1的活化是PI3K依賴性的。有文獻(xiàn)也報道，PI3K抑制條件下，胰島素誘導(dǎo)的Rac1上調(diào)及質(zhì)膜突起的形成受到抑制［20］。PI3K對Rac1活性的影響可能通過其與Rac1的鳥嘌呤核苷酸交換因子相互作用來實(shí)現(xiàn)［21］。

研究表明，活化的Rac1可以與IQGAP1相互作用并激活A(yù)rp2/3復(fù)合物、APC促進(jìn)肌動蛋白聚合及細(xì)胞遷移［22］。Tang 等［23］報道胸腺素 β4通過增強(qiáng)IQGAP1/Rac1信號通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移及臨床轉(zhuǎn)移。我們研究也發(fā)現(xiàn)IQGAP1可調(diào)控C.pn感染誘導(dǎo)的VSMCs黏附和遷移［24］。然而，在 C.pn感染誘導(dǎo)的VSMCs遷移過程中，Rac1與IQGAP1之間的相互關(guān)系目前尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，PI3K依賴的Rac1活化在C.pn感染誘導(dǎo)的VSMCs遷移中發(fā)揮重要作用，這一結(jié)果將為進(jìn)一步闡明C.pn感染誘導(dǎo)VSMCs遷移的分子機(jī)制以及尋找抑制VSMCs遷移和有效治療AS的途徑提供新思路。

［1］ Ross R.Atherosclerosis:an inflammatory disease［J］.N Engl J Med，1999，340(2):115-126.

［2］ Campbell LA，Yaraei K，Van Lenten B，et al.The acute phase reactantresponse to respiratory infection with Chlamydia pneumoniae:implications for the pathogenesis of atherosclerosis［J］.Microbes Infect，2010，12(8-9):598-606.

［3］ Zhao X，Bu DX，Hayfron K，et al.A combination of secondhand cigarette smoke and Chlamydia pneumoniae accelerates atherosclerosis［J］.Atherosclerosis，2012，222(1):59-66.

［4］ H?gdahl M，S?derlund G，Kihlstr?m E，et al.Expression of chemokines and adhesion molecules in human coronary artery endothelial cells infected with Chlamydia(Chlamydophila)pneumoniae［J］.APMIS，2008，116(12):1082-1088.

［5］ MacIntyre A， Abramov R， Hammond CJ， etal.Chlamydia pneumoniae infection promotes the transmigration of monocytes through human brain endothelial cells［J］.J Neurosci Res，2003，71(5):740-750.

［6］ Ridley AJ.Rho GTPases and actin dynamics in membrane protrusions and vesicle trafficking［J］.Trends Cell Biol，2006，16(10):522-529.

［7］ Sit ST，Manser E.Rho GTPases and their role in organizing the actin cytoskeleton［J］.J Cell Sci，2011，124(5):679-683.

［8］ Cain RJ，Ridley AJ.Phosphoinositide 3-kinases in cell migration［J］.Biol Cell，2009，101(1):13-29.

［9］ Welf ES，Ahmed S，Johnson HE，et al.Migrating fibroblasts reorient directionality by a metastable，PI3K-dependent mechanism［J］.J Cell Biol，2012，197(1):105-114.

［10］ Dawes AT，Edelstein-Keshet L.Phosphoinositides and Rho proteins spatially regulate actin polymerization to initiate and maintain directed movement in a one-dimensional model of a motile cell［J］.Biophys J，2007，92(3):744-768.

［11］張騰騰，張利軍，王蓓蓓，等.PI3K/Akt在肺炎衣原體感染誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移中的作用［J］.中國動脈硬化雜志，2012，20(3):207-211.

［12］權(quán) 偉，張利軍，陳 寧，等.肺炎衣原體感染通過PI3K通路誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移［J］.中國病理生理雜志，2010，26(7):1290-1294.

［13］王蓓蓓，張利軍，權(quán) 偉，等.肺炎衣原體感染對血管平滑肌細(xì)胞黏附和遷移的影響［J］.中國病理生理雜志，2010，26(12):2289-2294.

［14］ Gieffers J，Van Zandbergen G，Rupp J，et al.Phagocytes transmit Chlamydia pneumoniae from the lungs to the vasculature［J］.Eur Respir J，2004，23(4):506-510.

［15］ Gaydos CA，Summersgill JT，Sahney NN，et al.Replication of Chlamydia pneumoniae in vitro in human macrophages，endothelial cells，and aortic artery smooth muscle cells［J］.Infect Immun，1996，64(5):1614-1620.

［16］ Eitel J，Meixenberger K，van Laak C，et al.Rac1 regulates the NLRP3 inflammasome which mediates IL-1beta production in Chlamydophila pneumoniae infected human mononuclear cells［J］.Plos One，2012，7(1):e30379.

［17］ Gou?ffic Y，Guilluy C，Guérin P，et al.Hyaluronan induces vascular smooth muscle cell migration through RHAMM-mediated PI3K-dependent Rac activation［J］.Cardiovasc Res，2006，72(2):339-348.

［18］ Akunuru S，Palumbo J，Zhai QJ，et al.Rac1 targeting suppresses human non-small cell lung adenocarcinoma cancer stem cell activity［J］.PLoS One，2011，6(2):e16951.

［19］Lai Y，Shen Y，Liu XH，et al.Interleukin-8 induces the endothelial cell migration through the activation of phosphoinositide 3-kinase-Rac1/RhoA pathway［J］.Int J Biol Sci，2011，7(6):782-791.

［20］ Kotani K，Hara K，Kotani K，et al.Phosphoinositide 3-kinase as an upstream regulator of the small GTP-binding protein Rac in the insulin signaling of membrane ruffling［J］.Biochem Biophys Res Commun，1995，208(3):985-990.

［21］ Innocenti M， Frittoli E， Ponzanelli I， etal. Phosphoinositide 3-kinase activates Rac by entering in a complex with Eps8，Abi1，and Sos-1［J］.J Cell Biol，2003，160(1):17-23.

［22］ Watanabe T，Wang S，Noritake J，et al.Interaction with IQGAPI links APC to Racl，Cdc42，and actin filaments during cell polarization and migration［J］.Dev Cell，2004，7(6):871-883.

［23］ Tang MC，Chan LC，Yeh YC，et al.Thymosin beta 4 induces colon cancer cell migration and clinical metastasis viaenhancingILK/IQGAP1/Rac1 signaltransduction pathway［J］.Cancer Lett，2011，308(2):162-171.

［24］ Zhang L， LiX， Zhang L， etal. Chlamydophila(Chlamydia)pneumoniae infection promotes vascular smooth muscle cell adhesion and migration through IQ domain GTPase-activating protein 1［J］.Microb Pathog，2012，53(5-6):207-213.