激活FXR抑制MRL/lpr狼瘡小鼠肝損害的研究*

連 帆， 王 于， 李家平， 楊建勇， 范文哲， 張應(yīng)強(qiáng)， 許韓師， 梁柳琴， 楊岫巖

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是多系統(tǒng)損害的系統(tǒng)性自身免疫病，肝臟是常見(jiàn)的受累器官之一。據(jù)報(bào)道，SLE肝臟損害的發(fā)生率約為6% ～30%［1-2］。SLE引起的肝損害主要表現(xiàn)為肝腫大、黃疸、肝功能異常等，可以出現(xiàn)脂肪肝、門(mén)脈炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬化、膽汁淤積、肝細(xì)胞壞死等病理征象［3］。法尼酯衍生物X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)是一種主要在肝腸系統(tǒng)等組織器官表達(dá)的膽汁酸受體，屬于激素核受體超家族的一員，在膽汁酸代謝及膽固醇代謝中發(fā)揮重要作用［4］。近年來(lái)有研究指出，F(xiàn)XR具有抗炎和調(diào)節(jié)免疫的作用，F(xiàn)XR在自身免疫性疾病中有其獨(dú)特的作用［5-6］。前期研究表明，F(xiàn)XR受體激動(dòng)劑在動(dòng)物模型中可減輕肝臟炎癥損傷［7］。本研究旨在觀察FXR在SLE肝損害中的作用，探討FXR激活改善SLE肝損害的部分可能機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和動(dòng)物模型建立

雌性MRL/lpr小鼠和BALB/c小鼠(18周齡)購(gòu)自上海斯萊克公司。飼養(yǎng)環(huán)境溫度25℃恒溫，自由攝水，12 h交替照明。以伴刀豆球蛋白 A(concanavalin A，ConA;購(gòu)自Sigma)誘導(dǎo)肝損害。尾靜脈一次性注射 ConA 20 mg/kg。對(duì)照組注射0.5 mL 0.9%生理鹽水。

MRL/lpr小鼠FXR的激活:在ConA注射前14 d開(kāi)始，以含有1% 鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid，CDCA;FXR 激動(dòng)劑)［8］的飼料連續(xù)喂飼實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。對(duì)照組MRL/lpr小鼠和 BALB/c小鼠在注射ConA前喂飼普通飼料。另空白對(duì)照組小鼠不喂飼CDCA，并在尾靜脈中注射生理鹽水。

2 觀察指標(biāo)

2.1 測(cè)定指標(biāo) 在注射 ConA 后0、4、8、12、16和24 h取血，離心收集血漿，檢測(cè)肝功能損傷指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST);檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子干擾素 γ(interferon γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)。轉(zhuǎn)氨酶活性在全自動(dòng)生化儀(Hitachi)上檢測(cè)。細(xì)胞因子檢測(cè)按照Bio-Plex Suspension Array系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)流程操作。

2.2 qRT-PCR檢測(cè) FXR mRNA表達(dá) 采用 qRTPCR技術(shù)，以 β-actin作為內(nèi)參照，利用 Trizol-氯仿-異丙醇法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加入上游引物、下游引物和SYBR預(yù)混液等共20 μL(Applied Biosystems)，反應(yīng)體系在ABI PRISM 7700 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。FXR上游引物5’-CCCTGCTTGATGTGCTACAA-3’，下游引物 5’-GTGTCCATCACTGCACATCC-3’;β-actin 上游引物 5’-CAGCTGAGAGGGAAATCGTG-3’，下游引物 5’-CGTGCCAATAGTGATGACC-3’。所得結(jié)果以 FXR/β-actin的積分吸光度比值表示。

2.3 Western blotting檢測(cè)FXR蛋白表達(dá) 取-80℃保存的肝臟組織，在冰面上提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，制備上樣蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉1 h，0.3%TBST洗膜3次，加入I抗 FXR 抗體(Santa Cruz)，4 ℃孵育過(guò)夜，0.1%TBST洗膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的II抗(Santa Cruz)，室溫孵育1 h，洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光。以β-actin作為內(nèi)參照。

2.4 肝臟組織病理學(xué)檢查 取小鼠肝臟后，4%多聚甲醛固定24 h，逐級(jí)脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組均數(shù)比較采用Student's t檢驗(yàn);多組間均數(shù)比較用One-way ANOVA，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 FXR在MRL/lpr狼瘡小鼠肝臟中低表達(dá)

取MRL/lpr狼瘡小鼠與BALB/c小鼠肝臟組織，應(yīng)用qRT-PCR和Western blotting測(cè)定FXR的表達(dá)。結(jié)果顯示FXR mRNA及蛋白表達(dá)較BALB/c小鼠明顯降低，見(jiàn)圖1。

2 激活FXR減輕ConA誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎炎癥損傷

ConA誘導(dǎo)的肝臟損傷在病理上表現(xiàn)為肝細(xì)胞壞死、單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)、肝竇出血等。在激活FXR的MRL/lpr小鼠，ConA誘導(dǎo)的肝臟炎癥表現(xiàn)明顯減輕，見(jiàn)圖2。

Figure 2.FXR activation attenuated ConA-induced hepatitis(HE staining，×100).A:normal liver;B:ConA-induced hepatitis in BALB/c mice;C:ConA-induced hepatitis in MRL/lpr mice;D:ConA-induced hepatitis in MRL/lpr mice after FXR activation by CDCA.圖2 激活FXR減輕ConA誘導(dǎo)的肝損害

ConA誘導(dǎo)的小鼠肝損害還表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶活性的升高，峰值出現(xiàn)在注射ConA后12 h左右，隨后逐漸下降。在未受刺激時(shí)，BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠的轉(zhuǎn)氨酶水平相近，但在用ConA誘導(dǎo)肝損害后，MRL/lpr小鼠的轉(zhuǎn)氨酶活性明顯高于BALB/c小鼠。CDCA激活FXR的小鼠轉(zhuǎn)氨酶活性明顯低于MRL/lpr+ConA組，見(jiàn)圖3。

3 激活FXR減少炎癥因子的表達(dá)

BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠在注射ConA后，血清 TNF-α、IFN-γ和 IL-6的水平均明顯升高，以MRL/lpr小鼠的炎癥因子水平升高為著;而CDCA預(yù)處理的小鼠炎癥因子水平明顯降低，見(jiàn)圖4。

討 論

SLE是累及多器官、多系統(tǒng)的自身免疫性疾?。?-10］，肝臟是最常受累的器官之一，有報(bào)道，狼瘡肝損害在臨床上常被低估［3，11］。狼瘡肝損害的機(jī)制目前仍未明確，本研究探討FXR在狼瘡肝損害的作用，提示其激活可能減輕狼瘡肝損害，為狼瘡肝損害的治療提供了一個(gè)可能途徑。

Figure 3.FXR activation protected against liver injury in MRL/lpr mice.Mean±SD.n=10.*P ＜0.05 vs MRL/lpr+ConA.圖3 FXR激活對(duì)MRL/lpr小鼠肝臟的保護(hù)作用

Figure 4.FXR activation suppressed production of inflammatory cytokines in MRL/lpr mice.Mean ± SD.n=10.*P ＜0.05 vs MRL/lpr+ConA;△P＜0.05 vs BALB/c+ConA.圖4 FXR激活減少肝損害MRL/lpr小鼠炎癥因子釋放

FXR最初是作為膽汁酸運(yùn)送的受體而被認(rèn)識(shí)的，它已被證實(shí)參與了炎癥因子的表達(dá)［12-13］。FXR對(duì)肝臟自然殺傷T細(xì)胞的調(diào)節(jié)起作用［6］，在小腸和大腸炎癥中，F(xiàn)XR 激活減少 IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的分泌［14］。而本研究提供的證據(jù)表明FXR在狼瘡小鼠肝損害中起保護(hù)作用，F(xiàn)XR的激活能減輕肝損害。

MRL/lpr小鼠是高度模擬SLE的轉(zhuǎn)基因小鼠，在未受刺激時(shí)，MRL/lpr小鼠并未出現(xiàn)肝酶升高，這與前人的研究相吻合［14］。但我們的研究表明，F(xiàn)XR在MRL/lpr小鼠低表達(dá)，即使這些小鼠并未出現(xiàn)明顯肝損害的臨床征象。研究提示，F(xiàn)XR在狼瘡肝損害的病理生理機(jī)制中可能是一個(gè)負(fù)性調(diào)節(jié)因子，這一作用甚至存在于肝損害出現(xiàn)癥狀以前。

由于MRL/lpr小鼠和對(duì)照的正常BALB/c小鼠肝酶學(xué)在未受刺激時(shí)并無(wú)明顯差別。ConA誘導(dǎo)的肝臟炎癥是T細(xì)胞激活的結(jié)果，與SLE肝臟損害有許多相似之處，且伴有一系列炎癥因子的升高。在我們的研究中，MRL/lpr小鼠對(duì)ConA更為敏感，更易出現(xiàn)肝損害，這一點(diǎn)可部分解釋某些前人的研究，即MRL/lpr小鼠具有肝臟損害的趨向性，在較大周齡時(shí)容易出現(xiàn)自身免疫性膽管炎［15］。

CDCA激活FXR的MRL/lpr小鼠在ConA誘導(dǎo)的肝臟炎癥較 MRL/lpr+ConA組明顯減輕。TNF-α、IFN-γ和IL-6在狼瘡肝損害和ConA誘導(dǎo)的肝炎均有重要意義［16-18］。保護(hù)性因子IL-6和損傷性因子TNF-α、IFN-γ之間的平衡對(duì)肝損害的發(fā)生發(fā)展有重要作用。我們的研究顯示，在注射ConA后，MRL/lpr小鼠炎癥因子的水平較對(duì)照BALB/c更高，顯示其在未受刺激時(shí)可能存在某些未顯示出臨床癥狀的隱性病理狀態(tài)，因而對(duì)肝損害因子更敏感。激活FXR對(duì)MRL/lpr小鼠具有保護(hù)作用，其病理及炎癥因子表達(dá)均較FXR未激活組有明顯改善。這可能是因?yàn)镕XR在CD4、CD8、CD19和CD14陽(yáng)性的免疫細(xì)胞上表達(dá)，而CDCA激活FXR后減輕了T細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎［19］。

［1］ 余月明.系統(tǒng)性紅斑狼瘡肝臟損害83例臨床觀察［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2004，33(9):1394-1395.

［2］ 於 強(qiáng)，梅振武.系統(tǒng)性紅斑狼瘡的肝臟損害(附20例肝穿刺病理報(bào)告)［J］.風(fēng)濕病學(xué)雜志，1997，2(2):14-16.

［3］ Runyon BA，LaBrecque DR，Anuras S.The spectrum of liver disease in systemic lupus erythematosus:report of 33 histologically-proved cases and review of the literature［J］.Am J Med，1980，69(2):187-194.

［4］ Zhu Y，Li F，Guo GL.Tissue-specific function of farnesoid X receptor in liver and intestine［J］.Pharmacol Res，2011，63(4):259-265.

［5］ Zhang Y，Yin L，Anderson J，et al.Identification of novel pathways that control farnesoid X receptor-mediated hypocholesterolemia［J］.J Biol Chem，2010，285(5):3035-3043.

［6］ Mencarelli A，Renga B，Migliorati M，et al.The bile acid sensor farnesoid X receptor is a modulator of liver immunity in a rodent model of acute hepatitis ［J］.J Immunol，2009，183(10):6657-6666.

［7］ Xing X，Burgermeister E，Geisler F，et al.Hematopoietically expressed homeobox is a target gene of farnesoid X receptor in chenodeoxycholic acid-induced liver hypertrophy［J］.Hepatology，2009，49(3):979-988.

［8］ Lian F，Xing X，Yuan G，et al.Farnesoid X receptor protects human and murine gastric epithelial cells against inflammation-induced damage［J］.Biochem J，2011，438(2):315-323.

［9］ 袁 敏，沈 南，唐元家，等.DNA甲基化與系統(tǒng)性紅斑狼癥［J］.中國(guó)病理生理雜志，2012，25(11):2217-2220，2224.

［10］梁柳琴，陳偉玲，邱 茜，等.ROCK對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血T細(xì)胞黏附和遷移的調(diào)控［J］.中國(guó)病理生理雜志，2012，28(12):2270-2273.

［11］ Takahashi A，Abe K，Yokokawa J，et al.Clinical features of liver dysfunction in collagen diseases［J］.Hepatol Res，2010，40(11):1092-1097.

［12］ Kim I，Morimura K，Shah Y，et al.Spontaneous hepatocarcinogenesis in farnesoid X receptor-null mice［J］.Carcinogenesis，2007，28(5):940-946.

［13］ Yang F，Huang X，Yi T，et al.Spontaneous development of liver tumors in the absence of the bile acid receptor farnesoid X receptor［J］.Cancer Res，2007，67(3):863-867.

［14］ Vavassori P，Mencarelli A，Renga B，et al.The bile acid receptor FXR is a modulator of intestinal innate immunity［J］.J Immunol，2009，183(10):6251-6261.

［15］Ohba K，Omagari K，Murase K，et al.A possible mouse model for spontaneous cholangitis:serological and histological characteristics of MRL/lpr mice ［J］.Pathology，2002，34(3):250-256.

［16］Pasare C，Medzhitov R.Toll pathway-dependent blockade of CD4+CD25+T cell-mediated suppression by dendritic cells［J］.Science，2003，299(5609):1033-1036.

［17］ Wahl C，Wegenka UM，Leith?user F，et al.IL-22-dependent attenuation of T cell-dependent(ConA)hepatitis in herpes virus entry mediator deficiency［J］.J Immunol，2003，182(8):4521-4528.

［18］ Cao Q，Batey R，Pang G，et al.IL-6，IFN-γ and TNF-α production by liver-associated T cells and acute liver injury in rats administered concanavalin A ［J］.Immunol Cell Biol，1998，76(6):542-549.

［19］ Schote AB，Turner JD，Schiltz J，et al.Nuclear receptors in human immune cells:expression and correlations［J］.Mol Immunol，2007，44(6):1436-1445.