乙型肝炎病毒X蛋白抑制SFRP5啟動(dòng)子的活性*

陳林林， 謝 青，單曉亮， 權(quán)會(huì)琴，陳慶美， 周 帆，聶 丹， 唐 霓

全世界大約有4億人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，中國(guó)約占 1/3［1］。乙型肝炎病毒屬于嗜肝DNA病毒科，全長(zhǎng)3.2 kb，含有4個(gè)部分雙鏈的開放讀碼框，分別編碼核心蛋白、表面抗原、X蛋白以及病毒DNA聚合酶，其中乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)的生物學(xué)功能較活躍，已明確和腫瘤的發(fā)生相關(guān)。

分泌型卷曲相關(guān)蛋白(secreted frizzled-related proteins，SFRPs)家族作為腫瘤抑制蛋白，是Wnt/βcatenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的拮抗蛋白。分泌型卷曲相關(guān)蛋白5(secreted frizzled-related proteins 5，SFRP5)是SFRPs家族(SFRP1～5)成員之一，其表達(dá)下調(diào)可減弱對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制作用，促使通路活化，異常激活的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可參與人類多種腫瘤的發(fā)生［2-3］。有研究發(fā)現(xiàn)，HBx可通過激活 Wnt/β-catenin信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，從而參與原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinogenesis，HCC)的發(fā)生，但具體機(jī)制不明。本研究擬在細(xì)胞水平研究HBx能否影響SFRP5啟動(dòng)子活性，并且深入分析HBx下調(diào)SFRP5基因啟動(dòng)子的分子機(jī)制。

材料和方法

1 主要質(zhì)粒和細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞系 Huh 7、人正常肝細(xì)胞系LO2、螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-Basic、對(duì)照質(zhì)粒載體pRL-TK和大腸桿菌DH10B均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

2 主要試劑

Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen;限制性核酸內(nèi)切酶Nhe I和BglⅡ、T4 DNA連接酶、Wizard質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和基因組DNA提取試劑盒均為Promega產(chǎn)品;1%青/鏈霉素和MEM液體培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone;胎牛血清購(gòu)自Gibco;其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。引物序列見表1，由Invitrogen合成。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3 主要方法

3.1 SFRP5截短體啟動(dòng)子報(bào)告載體的構(gòu)建及鑒定根據(jù)SFRP5啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)5對(duì)截短體引物，擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為525 bp、858 bp、1 282 bp和1 724 bp和2 119 bp。首先提取Huh 7細(xì)胞基因組DNA作為模板，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增SFRP5啟動(dòng)子截短體。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，最適退火溫度退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃后延伸10 min，退火溫度及循環(huán)數(shù)見表1。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙啶染色后，用凝膠成像儀記錄。膠回收PCR產(chǎn)物與pGL3-Basic載體同時(shí)用 Nhe I和BglⅡ雙酶切，T4 DNA連接酶16℃過夜連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)菌。挑選陽性克隆，擴(kuò)增后小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定并測(cè)序。

3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及病毒感染 按4×105cells/well將LO2細(xì)胞鋪于60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)至50%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒2.25 μg，其中 pRL-TK質(zhì)粒用量均為 0.25 μg，質(zhì)粒分為 6 組，用量各 2 μg，分別命名為:pGL3-P1(－478 bp～+47 bp)，pGL3-P2(－811 bp～ +47 bp)，pGL3-P3(－1 235 bp～ +47 bp)，pGL3-P4(－1 677 bp～ +47 bp)，pGL3-P5(－2 072 bp～ +47 bp)，pGL3-Basic。次日將細(xì)胞重新鋪板，細(xì)胞貼壁后每組細(xì)胞按105個(gè)細(xì)胞鋪于24孔板中，分別感染最適滴度的感染編碼HBx的腺病毒(Ad-HBx)或編碼綠色熒光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，病毒感染后36 h收集細(xì)胞進(jìn)行螢光素酶活性檢測(cè)。

3.3 SFRP5啟動(dòng)子活性檢測(cè) 按照Promega公司雙螢光素酶檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，主要步驟為:PBS清洗細(xì)胞后加入 100 μL 1×passive lysis buffer，把裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5 mL Eppendorf管中，室溫14 000 r/min離心10 min，收集上清液。TK質(zhì)粒作為內(nèi)參對(duì)照標(biāo)化轉(zhuǎn)染效率，每組的相對(duì)螢光素酶活性用螢火蟲螢光素酶活性與海腎螢光素酶活性的比值來表示。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行獨(dú)立的3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SFRP5啟動(dòng)子截短突變體報(bào)告載體的構(gòu)建

如圖1所示，PCR擴(kuò)增的SFRP5啟動(dòng)子截短體長(zhǎng)度分別為 525 bp、858 bp、1 282 bp、1 724 bp 和2 119 bp。用Nhe I和BglⅡ限制性內(nèi)切酶對(duì)pGL3-P1～P5重組質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳，可見大小約 525 bp、858 bp、1 282 bp、1 724 bp和2 119 bp的條帶，符合預(yù)期結(jié)果，見圖2。DNA測(cè)序結(jié)果與PubMed所提供的人類SFRP5基因啟動(dòng)子序列完全一致，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Figure 1.PCR products of SFRP5 promoter.1:PCR product of 525 bp(－478 bp～ +47 bp);2:PCR product of 858 bp(－811 bp～ +47 bp);3:PCR product of 1 724 bp(－1 677 bp～ +47 bp);4:PCR product of 2 119 bp(－2 072 bp～ +47 bp);5:PCR product of 1 282 bp(－1 235 bp～ +47 bp);M:DNA marker 2000圖1 SFRP5啟動(dòng)子截短體的PCR擴(kuò)增

2 重組腺病毒病毒感染

采用Ad-HBx或Ad-GFP腺病毒來觀察和評(píng)估感染效率。感染后24 h倒置熒光顯微鏡可觀察到部分綠色熒光，HBx感染組和GFP對(duì)照組感染率沒有明顯差異，見圖3。

Figure 2.Identification of SFRP5 promoter recombinant plasmids by restriction enzyme digestion.1，3，5，7，9:pGL3-P1～pGL3-P5;2，4，6，8，10:pGL3-P1 ～ pGL3-P5 digested by Nhe I and BglⅡ;M:DNA marker 2000.圖2 SFRP5啟動(dòng)子區(qū)截短報(bào)告質(zhì)粒的酶切鑒定

3 HBx下調(diào)SFRP5啟動(dòng)子活性

將pGL3-P1～5或陰性對(duì)照質(zhì)粒pGL3-Basic與pRL-TK共轉(zhuǎn)染LO2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h分別感染Ad-GFP或Ad-HBx，同時(shí)以pGL3-Basic和pRL-TK共轉(zhuǎn)染組為對(duì)照組。pGL3-P1～5和pRL-TK共轉(zhuǎn)染LO2細(xì)胞，相對(duì)螢光素酶活性與對(duì)照組相比明顯升高，螢光素酶活性分別為(6.32±0.04)倍(－478 bp～+47 bp)、(5.79 ±0.32)倍 (－811 bp～ +47 bp)、(3.59±0.34)倍(－1 235 bp～ +47 bp)、(3.86±0.39)倍(－1 677 bp～ +47 bp)和(3.26±0.42)倍(－2 072 bp～+47 bp)(均P＜0.05)。過表達(dá)HBx后螢光素酶活性分別為(3.55±0.37)倍(－478 bp～+47 bp)(P＜0.05)、(3.15±0.25)倍 (－811 bp～+47 bp)(P＜0.05)、(2.59±0.34)倍(－1 235 bp～ +47 bp)、(2.96± 0.50)倍(－1 677 bp～ +47 bp)和(1.97±0.15)倍(－2 072 bp～ +47 bp)。分析后可觀察到HBx明顯抑制SFRP5啟動(dòng)子活性，抑制率分別為44%(－478 bp～+47 bp)(P＜0.05)、46%(－811 bp～ +47 bp)(P＜0.05)、28%(－1 235 bp～ +47 bp)、24%(－1 677 bp～ +47 bp)和40%(－2 072 bp～ +47 bp)，見圖4和表2。

Figure 3.Fluorescence images of LO2 cells 24 h after Ad-GFP(A)and Ad-HBx(B)infection(×200).圖3 熒光顯微鏡觀察腺病毒感染效率

Figure 4.Analysis of lusiferase activity of LO2 cells which were transfected with constructed plasmids and infected by Ad-GFP and Ad-HBx.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs pGL3-Basic;#P ＜0.05 vs GFP.圖4 SFRP5啟動(dòng)子截短體螢光素酶檢測(cè)

表2 螢光素酶活性分析Table 2.Analysis of luciferase activity(mean±SD.n=3)

討 論

已有報(bào)道HBV感染相關(guān)的肝癌組織中發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的異?；罨?-7］。Wnt/βcatenin信號(hào)通路異常活化的原因可能包括如β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、結(jié)腸腺瘤性息肉病相關(guān)因子(adenomatous polyposis coli，APC)等的突變和一些拮抗因子的異常失活。Wnt/β-catenin信號(hào)通路拮抗因子主要包括Dickkopf因子和SFRPs家族。SFRPs家族含有5個(gè)分泌型的糖蛋白家族成員(SFRP1～5)，SFRPs基因定位于染色體8p12～11.1，其蛋白約有300個(gè)氨基酸殘基，包括一個(gè)同源的N2末端和一個(gè)C2末端。SFRPs的分子結(jié)構(gòu)與Wnt受體極為相似，均具有相同的半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域，它們可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合fozivudine tidoxil(Fzd)受體而抑制Wnt信號(hào)通路的活化。

本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染不同區(qū)段的SFRP5啟動(dòng)子截短體后，－478 bp～+47 bp區(qū)域啟動(dòng)子活性最高，與對(duì)照相比，提高了6.32倍，用Ad-HBx感染后啟動(dòng)子活性明顯下降。這提示這個(gè)區(qū)域可能存在調(diào)控SFRP5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵元件，采用生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示此區(qū)域包括激活蛋白2(activator protein 2，AP-2)、GC 盒(GC box/C/EBP)等重要調(diào)節(jié)元件，對(duì)于SFRP5啟動(dòng)子的調(diào)控功能非常重要。但是HBx具體通過哪種機(jī)制下調(diào)SFRP5啟動(dòng)子活性，調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。

DNA甲基化和組蛋白去乙?；梢允筍FRPs啟動(dòng)子活性下降，可能導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的表觀修飾途徑之一，能抑制功能基因的表達(dá)［8］。研究發(fā)現(xiàn)除了甲基化修飾的DNA可直接作用于甲基化敏感轉(zhuǎn)錄因子，失去與DNA結(jié)合的能力從而阻斷轉(zhuǎn)錄，此外甲基化黏附分子可通過作用于甲基化非敏感轉(zhuǎn)錄因子，從而阻斷轉(zhuǎn)錄［9-12］。除了基因啟動(dòng)子區(qū)直接甲基化修飾調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄外，組蛋白修飾在基因表達(dá)調(diào)控中也起到至關(guān)重要的作用。在組蛋白H3上，共有5個(gè)賴氨酸位點(diǎn)可以被甲基化修飾，一般來說，組蛋白H3的4號(hào)賴氨酸(histone 3 lysine 4，H3K4)的甲基化主要聚集在活躍轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)域。組蛋白H3的9號(hào)賴氨酸(histone 3 lysine 9，H3K9)的甲基化同基因的轉(zhuǎn)錄抑制及異染色質(zhì)有關(guān)。EZH2(enhancer of zeste homolog 2)可以甲基化組蛋白H3的27號(hào)賴氨酸(histone 3 lysine 27，H3K27)，導(dǎo)致相關(guān)基因的沉默，并且與X染色體失活相關(guān)。組蛋白H3的36號(hào)賴氨酸(histone 3 lysine 36，H3K36)的甲基化與基因轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)［13-14］。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了SFRP5啟動(dòng)子區(qū)5個(gè)截短突變報(bào)告質(zhì)粒，通過對(duì)各個(gè)截短體轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控尋找核心啟動(dòng)子區(qū)域，為尋找影響啟動(dòng)子活性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子提供依據(jù);并且檢測(cè)了各區(qū)段啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)現(xiàn)HBx可以明顯下調(diào)SFRP5啟動(dòng)子區(qū)活性，提示HBx引起的SFRP5啟動(dòng)子區(qū)活性下降，可能參與Wnt信號(hào)的異?；罨?，并與HBV感染相關(guān)肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。

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