人脂肪干細(xì)胞復(fù)合Ⅰ型膠原支架材料構(gòu)建脂肪組織的實(shí)驗(yàn)研究

鐘振東，傅 榮，游曉波，魯 峰

(1.四川省醫(yī)學(xué)院科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院a.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，b.整形外科，四川 成都 610072;2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院整形外科，廣東 廣州 510515)

雖然組織工程已經(jīng)發(fā)展了近20年［1，2］，許多工程化組織和器官已經(jīng)出現(xiàn)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，有些已經(jīng)用于臨床。然而，應(yīng)用脂肪細(xì)胞組織工程技術(shù)修復(fù)軟組織缺損近期才引起學(xué)者們的關(guān)注［3～5］。雖然脂肪組織工程的方案還未到能夠應(yīng)用于臨床階段，但是已經(jīng)有體內(nèi)研究的證據(jù)［6～9］。2010～2012年四川省醫(yī)學(xué)院科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院與南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院通過將細(xì)胞和Ⅰ型膠原支架材料復(fù)合培養(yǎng)，移植裸鼠皮下，探討構(gòu)建工程化脂肪組織的適宜方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:42只出生4～6周的裸鼠(品系為BALB/c，體重18～23 g)。主要儀器:CO2培養(yǎng)箱(Heraeus，德國);液氮罐(CBS，美國);離心機(jī)(Heraeus，德國);倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)。主要試劑:DMEM、胎牛血清由 Gibco公司生產(chǎn);I型膠原酶、胰蛋白酶、I型膠原支架材料、四氮唑復(fù)合物(XTT)，硫酸酚嗪甲酯和二甲基亞砜均購自 Sigma，12孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自 Corning。

1.2 脂肪組織來源的脂肪干細(xì)胞(ADSCS) 原代、傳代培養(yǎng)取人吸脂術(shù)中吸出的脂質(zhì)部分，用緩沖液反復(fù)沖洗，剪刀剪碎。0.1%膠原酶37℃消化40 min，期間需反復(fù)震蕩混勻1次，使用等量體積的完全培養(yǎng)基中和后，離心1200 g×5 min，去上清，沉淀混懸后使用肽盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活性，加入10%DMEM培養(yǎng)基中，37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%即可傳代，取第3～4代細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)用。

1.3 細(xì)胞-支架復(fù)合物的形成 將膠原蛋白支架材料裁制成10 mm×10 mm×1 mm大小，利用紫外線照射及酒精浸泡消毒，培養(yǎng)液平衡后待用。培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為2×105/ml，表面種植0.2 ml細(xì)胞懸液，靜置4 h后，加入含20%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。

1.4 細(xì)胞-支架復(fù)合物移植 取4～6周齡大裸鼠，氯氨酮麻醉，常規(guī)消毒鋪巾。無菌條件下在其背部中線兩側(cè)皮下，對(duì)稱鈍性分離出2個(gè)潛腔，分別植入ASCs+材料(左側(cè))和空白材料(右側(cè))。無菌絲線縫合皮膚。

1.5 組織工程新生物大體觀察和生物學(xué)檢測(cè) 移植后12周處死動(dòng)物，將新生組織取出，給予大體觀察和濕重測(cè)定。組織工程新生物常規(guī)冰凍切片，倒置顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡，掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 所有裸鼠術(shù)后均活動(dòng)如常，植入處表面皮膚完整、光滑，無炎癥反應(yīng)，植入物無脫出，無免疫排斥反應(yīng)，無死亡。

2.2 組織工程新生物大體觀察和濕重測(cè)定 于移植后12周處死動(dòng)物，取出材料進(jìn)行大體觀察。從復(fù)合細(xì)胞的支架材料側(cè)獲取了約黃豆大小(約4 mm×4 mm×2 mm)的脂肪樣新生組織，空白支架對(duì)照側(cè)未見新生組織塊。對(duì)新生物進(jìn)行了濕重測(cè)定，新生組織平均濕重0.019 g，見圖1。

圖1 新生物取材 a:實(shí)驗(yàn)側(cè)新生組織;b:對(duì)照側(cè)(空白支架)無肉眼可見新生組織塊;c:新生物大體測(cè)量及濕重測(cè)定

2.3 組織學(xué)檢測(cè) 新生組織的HE染色觀察發(fā)現(xiàn)其組織結(jié)構(gòu)與正常脂肪組織相似(圖2a)且油紅0染色陽性(圖2b)，證明新生組織為脂肪組織。

3 討論

組織工程學(xué)的研究主要集中在生物可降解支架材料、種子細(xì)胞、體外培養(yǎng)條件等方面，其中理想的三維支架的構(gòu)建是組織工程化人工器官、組織研究成功的前提條件［9，10］。細(xì)胞與支架材料的相互作用是組織工程所需要考慮的關(guān)鍵問題之一，膠原蛋白是目前組織工程學(xué)研究中最常用的天然生物材料，由多種糖蛋白分子組成，占機(jī)體總蛋白的 30%(85%為I型膠原蛋白)，它具有多方面的生物活性，不僅是組織支持物，而且是細(xì)胞外間質(zhì)的重要成分［11，12］。研究表明，膠原蛋白生物相容性好，降解速度可調(diào)，而且可參與組織修復(fù)，是優(yōu)良的可引導(dǎo)組織再生的生物材料［13，14］。Ⅰ型膠原作為體外細(xì)胞培養(yǎng)支架時(shí)，有促進(jìn)細(xì)胞粘附和誘導(dǎo)生長(zhǎng)分化的作用，是良好的培養(yǎng)粘附劑［15，16］。故本實(shí)驗(yàn)選擇膠原蛋白支架作為研究對(duì)象。

圖2 新生物組織學(xué)檢測(cè)a:HE染色見正常脂肪組織樣結(jié)構(gòu)(×10);b:油紅0染色陽性，證實(shí)其含脂質(zhì)成分

我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，將成脂誘導(dǎo)后的脂肪干細(xì)胞與Ⅰ型膠原支架復(fù)合體外混合培養(yǎng)，植入裸鼠皮下培植12周后，形成了黃豆大小的脂肪樣組織，經(jīng)組織切片、油紅0染色等觀察證實(shí)為具有成熟結(jié)構(gòu)脂肪功能的脂肪組織，而對(duì)照側(cè)(空白支架)未形成脂肪組織。研究顯示，ASCs作為種子細(xì)胞的確可以應(yīng)用于脂肪組織的組織工程研究，并且能合成具有三維結(jié)構(gòu)及功能完整的脂肪組織［17］。另外，I型膠原支架是優(yōu)良的組織工程生物載體，其良好的生物相容性，對(duì)修復(fù)大范圍的軟組織缺損尤為理想［18，19］。

雖然本研究為今后的脂肪組織工程研究提供了一種可行的方案，但關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)，生物力學(xué)，細(xì)胞分化，新生血管，計(jì)算機(jī)模擬，支架生化特性等諸多方面仍需要大量細(xì)致的研究，才有可能將這項(xiàng)技術(shù)最終應(yīng)用于臨床患者。

［1］Gazit D，Turgeman G，Kelley P，et al.Engineered pluripoten mesenchymal cells in integrate and differentiate in regenerating bone:a novel cell mediated gene therapy［J］.J Gene Med，1999，1(2):121-133.

［2］Hong L，Peptan I，Clark P，et al.Ex vivo adipose tissue engineering by human marrow stromal cell seeded gelatin sponge［J］.Ann Biomed Eng，2005，33(4):511-517.

［3］Mauney JR，Vladimir V，Kaplan DL.Matrix-mediated retention of adipogeni-c differentiation potential by human adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells during ex vivo expansion［J］.Biomaterials，2005，26(31):6167-6175.

［4］張?jiān)扑桑呓ㄈA，魯峰等.I型膠原支架材料與人脂肪干細(xì)胞外生物相容性研究［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27(2):223-225.

［5］傅榮，游曉波.脂肪組織來源干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定［J］.實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2011，11(8):73-36.

［6］Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al.Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cell-based therapies［J］.Tissue Eng，2001，7:221-228.

［7］Mizuno H，Zuk PA，Zhu M，et al.Myogenic differentiation by human processed lipoaspirate cells［J］.Plast Reconstr Surg，2002，109:199.

［8］Zuk PA，Zhu M，Ashjian P，et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells［J］.Mol Cell Biol，2002，13:4279-4295.

［9］Hedrick MH，Daniels EJ.The use of adult stem cells in regenerative medicine［J］.Clin Plast Surg，2003，30:499-505.

［10］Ugarte DA De，Alfonso Z，Zuk PA，et al.Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow［J］.Immunol Let，2003，31:267-270.

［11］吳林波，丁建東.組織工程三維多孔支架的制備方法和技術(shù)進(jìn)展［J］.功能高分子學(xué)報(bào)，2003，16(1):91-96.

［12］Jeong WB，Bae YH，Kim S，et al.Biodegradable block copolymers as ingectable drug delivery systems［J］.Nature，1997，388:860-862.

［13］姚康德，尹玉姬.組織工程相關(guān)的生物材料［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2003:46-69.

［14］Ogawa R，Mizuno H，Watanabe A，et al.Osteogenic and chondrogenic differentiation by adipose-derived stem cells harvested from GFP transgenic mice［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，313(4):871-877.

［15］De Ugarte DA，Ashjian PH，Elarbary A，et al.Future of fat as raw material for tissue regeneration［J］.Ann Plast Surg，2003，50(2):215-219.

［16］Yoshimura K，Shigeura T，Matsumoto D，et al.Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates［J］.J Cell Physiol，2006，208(1):64-76.

［17］Lendeckel S，Jodicke A，Christophis P，et al.Autologous stem cells(adipose)and fibrin glue used to treat widespread traumatic calvarial defects:Case report.［J］.J Craniomaxillofac Surg，2004，32:370-373.

［18］Halvorsen YD，F(xiàn)ranklin D，Bond AL，et al.Extracellular matrix mineralization and osteoblast gene expression by human adipose tissuederived stromal cells［J］.Tissue Eng，2001，7(6):729-741.

［19］Mizuno H，Zuk PA，Zhu M，et al.Myogenic differentiation by human processed lipoaspirate cells［J］.Plastic and Reconstructive Surgery，2002，109(1):199-211.