酒醅微生物DNA提取預(yù)處理方法研究

沈才萍，李德林，沈才洪，3，鄧 波，3，沈小娟，3，敖宗華，，3

(1.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000;2.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000;3.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646000)

引言

運(yùn)用分子生物學(xué)相關(guān)方法對(duì)固態(tài)釀造食品中微生物進(jìn)行分子生態(tài)分析。不僅能克服經(jīng)典培養(yǎng)方法對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)特征信息研究丟失的局限，還可以更加可靠、快速地獲得發(fā)酵過程中各種微生物的菌落指紋特征，確定微生物的多樣性及其分類地位。對(duì)食品發(fā)酵進(jìn)行微生物分子生態(tài)研究，首先是需要獲得高質(zhì)量微生物總DNA。所以，發(fā)酵食品微生物總DNA提取是進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)研究的第一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)。能否快速成功獲得樣品的總DNA，獲得的總DNA質(zhì)量的高低直接影響整個(gè)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成?。?］。在富含多糖、鹽、淀粉、腐殖酸和代謝色素酚等雜質(zhì)的酒醅環(huán)境中提取微生物總DNA，這些雜質(zhì)不易與DNA樣品分離，而它們的存在會(huì)抑制DNA聚合酶活性，導(dǎo)致后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)失敗。

環(huán)境樣品總DNA預(yù)處理方法可概括為兩類:直接法和間接法，直接法是先用溶液溶解樣品中的雜質(zhì)，通過反復(fù)離心等方法獲得樣品沉淀，該操作能除去環(huán)境樣品中水溶性雜質(zhì)，還能減少微生物在預(yù)處理中的丟失;間接法提取是通過梯度離心、離心洗滌等步驟出去樣品雜質(zhì)，然后再收集菌體，該過程容易造成微生物種類和數(shù)量的丟失，但能夠得到較高質(zhì)量的DNA。根據(jù)環(huán)境樣品的差異采用合適的預(yù)處理方法，能夠保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。在此，本實(shí)驗(yàn)研究了不同預(yù)處理方法，以獲得一種適合酒醅環(huán)境中微生物總DNA提取預(yù)處理的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

酒醅樣品采集于瀘州老窖羅漢基地濃香型白酒窖池。取樣后迅速置于-80℃冰箱保藏，備用。

1.2 主要試劑與儀器

試劑:蛋白酶k(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)、無(wú)菌水、TENP緩沖液、PBS緩沖液。

儀器:PCR儀(美國(guó)BIORAD)、DGGE電泳儀(美國(guó)BIORAD)、高速離心機(jī)(日本HITICHI)、核酸蛋白檢測(cè)儀(德國(guó)Eppendorf)。

1.3 酒醅預(yù)處理

稱取0.5 g酒醅樣品于50 mL離心管，分別按照下面方法進(jìn)行。

方法A(無(wú)菌水):離心管加入3 mL無(wú)菌水和0.3 g玻璃珠，漩渦震蕩5 min，10 000 rpm離心5 min，棄上清。在沉淀中加入3 mL無(wú)菌水重復(fù)上述操作2次，取沉淀。

方法B(TENP):離心管加入3mL TENP緩沖液和0.3 g玻璃珠，漩渦震蕩5 min，10 000 rpm離心5 min，棄上清。在沉淀中加入3mL TENP緩沖液重復(fù)上述操作2次，取沉淀。

方法C(PBS):離心管加入3 mL PBS緩沖液和0.3 g玻璃珠，漩渦震蕩5min，200×g離心5 min，吸取上清液。在沉淀中加入3 mL PBS緩沖液重復(fù)洗滌兩次，合并三次上清液，12 000 rpm離心5 min，取沉淀。

1.4 DNA的提取和純化［2］

預(yù)處理后的沉淀中加入1 mL DNA抽提液(100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，100 mmol/L EDTA，100 mmol/LNa3PO4，1.5 mol/L NaCl)和5μ蛋白酶k(20 mg/mL)，200 r/min搖床37℃下30 min，在加入500μL 10%SDS 65℃水浴1 h。水浴后的樣品4℃下6000×g離心10 min，小心吸取上清于2 mL離心管，加入等體積酚氯仿異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，12 000 rpm離心10 min，取上清加入等體積氯仿異戊醇(24∶1)12 000 rpm離心10 min，取上清，重復(fù)兩次。上清液加入0.6體積預(yù)冷的異丙醇-20℃沉淀1 h，12 000 rpm離心10 min，小心倒掉液體。沉淀用70%乙醇洗滌數(shù)次。洗滌后的DNA用吹風(fēng)吹干后TE溶解，-20℃保存。

1.5 DNA核酸蛋白儀檢測(cè)

提取的DNA樣品在核酸蛋白儀中測(cè)其OD230、260、280、340及OD260/280、OD260/230。

1.6 細(xì)菌v3區(qū)PCR

(1)引物:16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增所用的引物采用Muzyer等人所用的引物，可以擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)約196bp的片段，對(duì)應(yīng)E.coli16S rDNA 341到534的位點(diǎn)。在片段的一端加了富含GC的片段(GC clamp)，序列如下:

(2)PCR反應(yīng)體系及程序:PCR反應(yīng)需進(jìn)行兩輪，第一輪反應(yīng)體系為25μL:0.2μL Taq酶(5 u/μL)，2 μL dNTPs(2.5 mM)，2.5μL10×buffer，引物(10 pM)各1μl，模板DNA(10 ng)，18.3μL滅菌雙蒸水。程序:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性1 min，應(yīng)用降落PCR，65℃開始退火，每?jī)奢喗档?℃，最終降至56℃，退火1min，72℃延伸1 min;再94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共10個(gè)循環(huán)，72℃終延伸6 min。第二輪PCR反應(yīng)(50μL):0.5μl Taq酶(5 u/μL)，4μL dNTPs(2.5 mM)，5μL10×buffer，引物(10 pM)各1μl，第一輪PCR產(chǎn)物模板DNA(5μL)，33.5μL滅菌雙蒸水，94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共10個(gè)循環(huán)，終延伸72℃10 min。兩輪PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離檢驗(yàn)，電壓約11 V/cm，電泳時(shí)間20 min，凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.7 DGGE電泳

DGGE電泳條件:8%聚丙烯酰胺凝膠，DGGE采用30%～50%變性梯度(100%變性劑濃度為7 M尿素，40%甲酰胺)，上樣量為80 uL的PCR產(chǎn)物。電泳緩沖液為1×TAE，60℃，200 V電壓電泳3.5 h，SYBR GreenⅠ染色45 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 核酸蛋白儀檢測(cè)結(jié)果分析

蛋白核酸定量檢測(cè)儀測(cè)定三種方法所提總DNA在280 nm、260 nm與230 nm下光吸收值，并以A260/A280與A260/A230分析DNA純度，根據(jù)DNA濃度換算出每克酒醅樣品中DNA含量。每種方法重復(fù)4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(n=4)，DNA濃度與DNA提取量以4次重復(fù)試驗(yàn)的表示。P≤0.01表示具有顯著差異。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用STATA統(tǒng)計(jì)軟件分析完成。結(jié)果見表1。

表1 不同預(yù)處理方法提取DNA比較

從表1結(jié)果可以看出三種預(yù)處理方法均得到較高濃度的DNA，其中無(wú)菌水處理的樣品平均值達(dá)到95.725±2.804μg/mL，其次是PBS處理樣品平均值為66.375±4.224μg/mL，濃度最低為TENP處理樣，其平均值為56.475±9.601μg/mL。從獲得DNA濃度分析，無(wú)菌水處理樣品明顯高于其余兩種方法，而PBS緩沖液和TENP緩沖液處理樣DNA濃度差別不大。其原因可能由于TENP中的PVP與酒醅中的腐殖酸、酚類物質(zhì)結(jié)合的時(shí)候，少量DNA分子也結(jié)合在一起，留在上清液中，造成DNA的損失。PBS處理是通過多次懸浮細(xì)胞來(lái)獲得菌體，由于少量細(xì)菌與酒醅結(jié)合在一起，振蕩后少量菌體仍留在酒醅中而損失。

DNA的純度可通過A260/A280比值表示，比值在1.8～2.0說(shuō)明DNA純度較好，比值低于1.8說(shuō)明樣品DNA存在蛋白質(zhì)污染，比值高于2.0說(shuō)明樣品存在RNA污染。樣品雜質(zhì)的含量可以通過A260/A230比值來(lái)確定，即比值越高，雜質(zhì)含量越低。無(wú)菌水、TENP、PBS三種預(yù)處理方法獲得的DNA樣品A260/A280平均值分別為1.645±0.045、1.535±0.047和1.855±0.024。其中無(wú)菌水和TENP處理樣低于1.8，說(shuō)明樣品中存在蛋白質(zhì)污染。無(wú)菌水處理樣品雖然DNA濃度較高，但各種雜質(zhì)含量也是最高的，反映出DNA濃度越高其雜質(zhì)含量也就越多，原因可能是雜質(zhì)與DNA分子之間存在相互結(jié)合，其機(jī)理還未見相關(guān)報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。TENP緩沖液中的PVP可以和苯酚基化合物形成氫鍵，國(guó)內(nèi)外大部分方法也應(yīng)用PVP或是不溶性的聚乙烯聚吡咯烷酮去除腐殖酸［3-4］。從數(shù)據(jù)中可以看出用TENP處理樣品OD A340較低，說(shuō)明TENP對(duì)去除樣品中的酚、腐殖酸有一定的效果。經(jīng)過PBS處理的樣品，經(jīng)過高速離心后，大量雜質(zhì)都沉淀下來(lái)，從而獲得較純凈的菌液懸浮。

2.2 PCR擴(kuò)增分析

圖1為第一輪PCR產(chǎn)物電泳圖，圖2為以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板電泳圖，三種預(yù)處理方法均在預(yù)測(cè)大小片段200 bp處有目的條帶，擴(kuò)增片段越清晰，條帶越明亮，擴(kuò)增出目的DNA濃度越高。無(wú)菌水與TENP處理的樣品條帶較暗，PBS處理后的樣品，均有較亮條帶，說(shuō)明PBS方法能較好的擴(kuò)增出目的基因。

DNA模板中腐殖酸的存在，可以螯合Mg2+也可與DNA、蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，從而抑制Taq酶的活性［5］。模板中蛋白質(zhì)存在會(huì)阻礙引物與模板的結(jié)合，影響PCR擴(kuò)增。無(wú)菌水樣品雖然DNA濃度較高，但雜質(zhì)含量也高，從圖1、圖2看出，雜質(zhì)較高的無(wú)菌水和TENP處理的樣品，其擴(kuò)增目的DNA條帶較暗，證明了DNA模板中雜質(zhì)會(huì)影響PCR擴(kuò)增。PBS處理樣品中DNA濃度不高，但雜質(zhì)含量較低，其擴(kuò)增條帶明亮，能很好的擴(kuò)增目的基因片段，說(shuō)明經(jīng)過該方法處理后獲得的酒醅微生物DNA，適合進(jìn)行后續(xù)的操作。

2.3 V3區(qū)擴(kuò)增片段DGGE分析

PCR-DGGE用于微生物群落結(jié)構(gòu)的分析，一般要求目的片段在500 bp以下，對(duì)細(xì)菌群落的分析通常采用16S rRNA V3區(qū)片段［6-7］。根據(jù)DGGE能分離長(zhǎng)度相同而序列不同DNA的原理，圖譜中不同條帶代表不同的細(xì)菌，電泳條帶越多表明分離的細(xì)菌種屬越多，條帶亮度越強(qiáng)表示該條帶代表的相應(yīng)細(xì)菌數(shù)量越多［8-9］。三種預(yù)處理方法獲得的DGGE圖譜(圖3)中條帶的位置和數(shù)目均有差異，有的條帶位置相同但亮度(粗細(xì))不同，對(duì)應(yīng)其在DGGE梯度膠上的密度大小不同，有的條帶在DGGE梯度膠上出現(xiàn)的位置不一樣，有的則顯示空缺。無(wú)菌水處理的樣品有五條明顯條帶且條帶亮度較暗，TENP和PBS處理樣品獲得的DGGE圖譜具有相近的條帶數(shù)、條帶位置及相對(duì)豐度，表明兩種方法獲得的基因組DNA中菌群結(jié)構(gòu)相似性較高。圖像圖譜分析表明PBS處理方法偵測(cè)條帶最高(Int值最高)，TENP處理方法次之，無(wú)菌水處理方法條帶最少。將三種方法處理的樣品獲得的相同優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行峰面積積分(表2)。其中PBS處理方法獲得的各條帶清晰度最高。

圖3 細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)擴(kuò)增片段DGGE圖譜

表2 細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)擴(kuò)增片段DGGE指紋圖譜峰面積積分

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在三種預(yù)處理方法基礎(chǔ)上，采用SDS高鹽+蛋白酶K的方法提取得到酒醅中的微生物總DNA。實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，DNA樣品中的雜質(zhì)會(huì)嚴(yán)重影響PCR擴(kuò)增，且DNA中雜質(zhì)含量與DNA濃度成正相關(guān)，DNA濃度越高其雜質(zhì)含量也高。無(wú)菌水和TENP處理的樣品在PCR第一輪和第二輪中擴(kuò)增出條帶較暗，最終DGGE圖譜條帶數(shù)目與亮度也較差。PBS處理的樣品能很好的擴(kuò)增出目的基因，DGGE圖譜分析及相似性分析均表明PBS處理方法較佳，通過PBS處理方法獲得的基因組DNA其DGGE圖譜中條帶明亮、豐度高，能很好反映樣品細(xì)菌的多樣性，有利于相關(guān)分子生物學(xué)分析。

分子生物學(xué)廣泛應(yīng)用于酒醅微生物生態(tài)學(xué)研究中［10］，如用于構(gòu)建環(huán)境微生物基因庫(kù)，用于動(dòng)態(tài)分析群落變化規(guī)律以及微生物釀酒環(huán)境關(guān)系研究等。如何快速高效提取適于進(jìn)一步分子生物學(xué)操作的微生物總DNA的方法成為關(guān)鍵技術(shù)。對(duì)酒醅樣品進(jìn)行預(yù)先處理，是一種簡(jiǎn)單有效的方法，能有效地去除大量雜質(zhì)，保證后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。本文比較了三種不同預(yù)處理方法，最終確定了PBS處理法為酒糟最佳預(yù)處理方法，可用于酒醅環(huán)境中細(xì)菌基因組DNA的提取。

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