內皮抑素重組腺病毒治療肝癌裸鼠模型的實驗觀察*

龍洪清

(湖北科技學院臨床醫(yī)學院腫瘤學與核醫(yī)學教研室，湖北咸寧437100)

惡性腫瘤包括肝癌在內的實體瘤主要依賴新血管的生成以及遠處轉移對機體構成嚴重危害。因此，針對新生血管生成治療，是針對包括肝癌在內的惡性腫瘤進行治療的一個重要策略［1，2］。內皮抑素(Endostatin)對體外內皮細胞增殖具有明顯抑制活性，體內亦可特異性抑制內皮細胞增殖和新生血管形成，抑制腫瘤生長。惡性腫瘤治療方法中基因治療是近些年研究較熱的一種重要方法。如何準確有效將外源基因導入惡性腫瘤細胞，是有效治療腫瘤的關鍵技術。病毒載體中腺病毒是被證明最有前途的基因治療載體。本實驗利用已成功構建的內皮抑素重組腺病毒Ad-endostatin［3］，用HUVEC 細胞觀察抑制作用，用裸鼠制備HepG2肝癌細胞荷瘤模型，通過瘤內注射Ad-endostatin，了解其對腫瘤血管生成的抑制作用，為臨床實施重組基因技術治療惡性腫瘤提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

HUVEC 細胞，HepG2細胞，購自武漢大學生命科學細胞庫;雌性BALB/C 裸鼠，6～8周齡，體質量20g 左右，由華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 MTT 法觀察Ad-endosatin 對細胞生長的抑制作用

HUVEC 細胞種植于96孔板中，每孔1×104細胞，置于37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)過夜。設Ad-Endo 感染組、Ad-EGFP 感染組(Mock 組)和未處理組(PBS 組)。待培養(yǎng)細胞貼壁后再感染細胞。Ad-Endo 感染組分別加入10、50感染復數(MOI)的Ad-Endo 病毒感染1h，換液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48h 后，用無菌槍尖吸去培養(yǎng)液。以完全培養(yǎng)基稀釋MTT，終濃度為5mg/ml，每孔加入10μl，將細胞放回5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4h，再吸去含MTT 的培養(yǎng)基，每孔加入150μl 二甲亞砜(DMSO)，用酶標儀在490nm 波長處讀取吸收值。Ad-EGFP 感染組分別加入10、50MOI Ad-EGFP，方法同Ad-Endo 感染組。以PBS 組的吸收值為100%作對照，檢測細胞活性，計算細胞增殖抑制率。

1.2.2 動物模型的建立與治療作用觀察

雌性BALB/C-nu 裸小鼠共15只，作為可移植性肝癌HepG2腫瘤模型宿主。所有裸鼠均飼養(yǎng)于標準無菌隔離小籠。于裸鼠皮下接種約5×106個腫瘤細胞，接種9d 后(腫瘤大小約100mm3)，將小鼠隨機分為3組:PBS 對照組、Ad-EGFP 組、Ad-Endo 治療組，每組小鼠5只。分組后開始進行瘤內注射治療。治療組采用Ad-Endo 2×109Pfu/100μl PBS，每隔3d 瘤內多點注射1次;Ad-EGFP 組采用Ad-EGFP 2×109Pfu/100μl PBS，PBS 對照組采用100μl PBS。觀察腫瘤體積生長變化。每3d 1次稱重小鼠，用游標卡尺測量皮下腫瘤最大經(a)最小經(b)，計算腫瘤體積V=ab2/2，取均值繪制腫瘤體積變化曲線。

1.2.3 腫瘤組織微血管密度觀察

治療21d 后處死小鼠，迅速取出腫瘤組織，10%中性甲醛固定。采用常規(guī)ABC 免疫組織化學染色方法，所選一抗為大鼠抗小鼠CD31單克隆抗體，二抗為生物素標記的兔抗大鼠IgG。腫瘤組織平均血管密度(MVD)以血管內皮細胞CD31抗原表達程度判斷。在顯微鏡下計數6個高倍鏡(200倍)視野中CD31陽性細胞數，每個視野平均數為MVD。

1.3 統(tǒng)計分析

實驗結果以均數±標準差表示，統(tǒng)計采用SPSS 13.0軟件包計算處理。資料差異比較采用t檢驗。統(tǒng)計學分析均以а=0.05為標準檢驗水準，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖抑制分析

MTT 法檢測HUVEC 細胞感染后的細胞活性。Ad-EGFP 感染組(Mock 組)和未處理組(PBS組)的細胞僅僅出現較弱的非特異細胞增殖抑制。Ad-Endo 感染組明顯抑制HUVEC 細胞增殖。當使用10 MOI 的病毒時，感染24、48h 后的細胞活性分別為(87.61±4.59)%、(81.48±3.88)%;當使用50 MOI 的病毒時，感染24、48h 后的細胞活性分別下降到(79.30±3.76)%、(63.75±2.82)%，如圖1A。感染復數增加，感染時間延長，細胞活性明顯下降，t=3.132，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Ad-Endo 感染組中檢測到Endostatin 蛋白在靶細胞中的表達，如圖1B 所示。

圖1 HUVEC 細胞活性變化

2.2 體內腫瘤治療實驗結果

裸鼠皮下腫瘤組織體積變化，如圖2顯示，Ad-Endo 治療組小鼠皮下腫瘤組織均出現了一定的治療效果，治療21d 后，PBS 對照組腫瘤體積895±44mm3，Ad-EGFP 組683±33mm3，Ad-Endo治療組435±26mm3，與PBS 對照組相比，Ad-Endo治療組腫瘤生長體積抑制率達到51.40%，t=19.819，差異具有顯著性(P＜0.001)。

圖2 BALB/c 荷瘤裸鼠腫瘤生長體積變化曲線

2.3 腫瘤組織微血管密度檢測結果

免疫組織化學檢測腫瘤組織切片中的腫瘤微血管生成情況，如圖3所示。結果顯示在Ad-Endo 治療組，小鼠腫瘤切片中腫瘤組織微血管生成明顯減少，每個高倍鏡視野平均CD31陽性細胞數MVD 為68.34±3.29，明顯低于Ad-EGFP 組96.06±4.38和PBS 對照組113.28±5.20，t=12.600，差異具有顯著性(P＜0.001)。

圖3 腫瘤組織切片CD31表達的免疫組化分析

(A)、(B)和(C)分別為用PBS、Ad-EGFP 和Ad-Endo治療荷瘤小鼠腫瘤組織石蠟切片ABC 法免疫組化染色。在顯微鏡下觀察CD31陽性細胞(棕色)。(200×)

3 討論

腫瘤新血管的生成為正在生長的腫瘤獲得足夠的營養(yǎng)和氧氣，這對于腫瘤來說非常重要。Folkman 等［4］證明除非有新血管生成，否則腫瘤不可能超過幾毫米。血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡控制新血管的生成。目前，已經鑒定了各種不同的血管生成因子和血管生成抑制因子，其中一些血管生成因子或抑制因子通過分子生物技術改造，逐步進入臨床試驗或臨床應用階段。

內皮抑素(Endostatin)由膠原蛋白XⅧ的羧基末端非膠原區(qū)內的184個氨基酸構成，其分子量為20KD，是眾多內源性血管形成抑制因子之一，它的出現曾經在生物學界引起巨大轟動。其特點是:①大劑量給藥也不引起毒性和不良反應;②每天靜脈滴注不同劑量的Endostatin，可見腫瘤內血流和代謝明顯下降;③Endostatin 不影響生理性創(chuàng)傷愈合，但可抑制病理性血管形成。有研究表明，將Lewis 肺腫瘤移植到鼠體內，生長至100～200mm3時用Endostatin 進行全身性治療，能有效地抑制原發(fā)腫瘤的生長，劑量愈大，效用愈強。為使腫瘤持續(xù)消退并維持于休眠狀態(tài)，內皮抑素必須長期應用。但是其理化性質活潑，不穩(wěn)定，易變性;分離提純過程復雜，大量制備比較困難。因此，制約了其大量生產和廣泛應用。然而，基因重組導入治療技術可以避免大量制備內皮抑素比較困難的難題，為腫瘤治療提供了新思路和新方法。楊志廣等人［5］構建了帶有分泌信號的內皮抑素原核表達載體pFLAG-ssEndostatin。于磊等人［6］構建了腺相關病毒(rAAV)-腫瘤內皮抑素(tumstatin)載體rAAV-Tum，體外實驗表明該病毒能高效誘導內皮細胞凋亡。筆者［3］成功構建人內皮抑素重組腺病毒Ad-endostatin，實驗表明它使HEK293細胞出現明顯病變效應。本研究利用已構建成功的重組腺病毒Ad-endostatin，觀察其對HUVEC 細胞增殖的抑制作用。實驗表明感染復數增加，感染時間延長，抑制作用明顯增強。

對惡性腫瘤細胞進行直接殺滅或抑制作用是對腫瘤進行有效治療的重要方式。王榮等人［7］用帶有內皮抑素基因真核細胞表達載體質粒導入裸鼠ACHN 腎細胞癌(RCC)細胞中，結果內皮抑素表達質粒能顯著抑制裸鼠ACHN 的RCC 腫瘤體積增長。Li S 等人［8］用人工合成內皮抑素核苷酸序列編碼25-31氨基酸，Peptide 30，觀察到能夠有效抑制HepG2腫瘤細胞黏附、侵襲和遷移。本實驗采用重組腺病毒Ad-Endo，瘤內注射治療HepG2肝癌細胞制備的裸鼠腫瘤模型，采用多時間點注射，對肝癌腫瘤組織生長抑制率達到51.40%。進一步說明內皮抑素對腫瘤細胞生長具有明顯抑制作用。機制可能是由于重組腺病毒Ad-Endo 具有感染效率高的特點，能夠有效將目的基因轉入腫瘤組織細胞中，通過持續(xù)表達內皮抑素，對裸鼠皮下接種HepG2肝癌細胞增殖生長具有明顯抑制作用，而且作用持久。更可能是與內皮抑素抑制腫瘤組織中血管內皮細胞增殖，促進內皮細胞凋亡有關，使腫瘤細胞營養(yǎng)缺乏數量減少，在總體上表現為腫瘤生長變慢、體積縮小。

CD31是血管內皮細胞的重要標記。Xie L等［9］研究了腫瘤血管生成過程中內生血管生成抑制劑(EAIs)的作用，進一步驗證了血管生成平衡假說理論。本實驗中，在Ad-Endo 治療組，用免疫組化染色顯示肝癌組織中血管生成明顯減少，每6個高倍鏡視野中平均CD31陽性細胞數68.34，明顯低于Ad-EGFP 組(96.06)和PBS 對照組(113.28)。實驗結果說明腺病毒介導的內皮抑素，明顯抑制腫瘤模型中腫瘤組織新生血管的生成，打破了血管生成平衡，為進行內皮抑素基因治療提供了實驗依據。

［1］Folkman J.Antiangiogenesis in cancer therapy-endostatin and its mechanisms of action［J］.Exp Cell Res，2006，312:594

［2］Folkman J.Angiogenesis:an organizing principle for drug discovery［J］.Nat Rev Drug Discov，2007，6:273

［3］龍洪清.重組腺病毒Ad-Endostatin 載體構建與表達檢測［J］.咸寧學院學報(醫(yī)學版)，2012，26(2):96

［4］Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications［J］.New Engl J Med，1971，285:1182

［5］楊志廣，劉林林，蘇清秀，等.小鼠分泌型內皮抑素原核表達載體pFLAG-ssEndostatin 的構建［J］.中國實驗診斷學，2010，14(3):378

［6］于磊，孫巖，雷銘德，等.腫瘤血管內皮抑素tumstatin腺相關病毒載體的構建及其功能的初步鑒定［J］.實用醫(yī)學雜志，2010，26(7):1100

［7］王榮，曾進，蔣林濤，等.內皮抑素基因對ACHN RCC細胞增殖和凋亡的影響［J］.現代泌尿生殖腫瘤雜志，2010，2(2):108

［8］Li S，Wei J，Yuan L，et al.RGD-modified endostatin peptide 30 derived from endostatin suppresses invasion and migration of HepG2 cell through the αγβ3 pathway［J］.Cancer Biother Radiopharm.2011，26(5):529

［9］Xie L，Duncan MB，Pahler J，et al.Counterbalancing angiogenic regulatory factors control the rate of cancer progression and survival in a stage-specific manner［J］.Proc Natl Acad Sci USA.2011，108(24):9939