人參皂甙Rb1 減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究

黃 飛，李亞男，尹 飛，趙東旭，朱慶三

脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemiareperfusion injury，SCII)一直是神經(jīng)科學(xué)研究的難點(diǎn)之一，SCII 是指在某種損傷因素作用下脊髓經(jīng)過一定時(shí)間缺血后得到血液再灌注后出現(xiàn)明顯的功能障礙，甚至出現(xiàn)不可逆性脊髓神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的現(xiàn)象［1-2］。SCII 的主要損傷因素在于再灌注后的繼發(fā)性損傷，決定了SCII 的預(yù)后。因此，保護(hù)脊髓神經(jīng)元，避免脊髓水腫，是治療SCII 的關(guān)鍵所在［3-4］。目前SCII 的臨床防治方法主要包括缺血預(yù)適應(yīng)，低溫、低流、低壓再灌注，藥物治療和物理治療，但是都不能從根本上改善SCII 的預(yù)后［5-7］。而且上述治療手段均以對癥治療為主，患者住院時(shí)間長，花費(fèi)大，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。因此，找到一種切實(shí)有效、毒副作用小的治療方法具有重大的社會意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

人參作為中國傳統(tǒng)中藥，具有藥性溫和、藥理作用廣泛的特點(diǎn)，一直廣泛應(yīng)用于臨床。已有的研究發(fā)現(xiàn)，人參發(fā)揮作用的主要成分之一為人參皂甙，其是從人參在地表以上莖葉中提取的有效成分，目前提純的單體成分有50 多種［8-9］。近年來，我國學(xué)者嘗試將人參皂甙應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病及損傷當(dāng)中，取得了一定療效，但尚缺乏人參皂甙對神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用的機(jī)制研究。在人參皂甙的多種單體中，人參皂甙單體Rb1 具有突出的抗氧化清除自由基、抗細(xì)胞凋亡和改善心肌缺血再灌注損傷等作用［10-11］。而SCII 中也涉及過量氧自由基產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡等因素［12-13］，因此推測人參皂甙Rb1 可能對SCII 有一定的治療意義。因此本部分研究擬闡明人參皂甙Rb1 對SCII 的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物

健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，清潔級，體重(220±20)g，吉林大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證為SCXK(吉)2008-0005。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。每天12 h 光照時(shí)間，自由取食飲水。

1.2 藥物

人參皂甙Rb1(純度99.9999%)為吉林大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用0.9%生理鹽水將人參皂甙Rb1 配置濃度為5 mg/mL 的溶液待用。

1.3 模型的建立

1.3.1 SCII 模型

將大鼠麻醉、固定，于大鼠的左側(cè)肋骨下緣中線做3 cm 左右切口，找到左側(cè)腎臟位置，進(jìn)而確認(rèn)腎動脈，沿腎動脈尋找腹主動脈，于腎動脈分支水平以下分離腹主動脈，用10 g 標(biāo)準(zhǔn)動脈夾持續(xù)結(jié)扎60 min，期間切口用生理鹽水紗布覆蓋。60 min 后取出動脈夾，局部撒青霉素粉2×105單位后關(guān)閉腹腔。

1.3.2 假手術(shù)組模型

過程同SCII 模型，但是不需結(jié)扎腹主動脈，同樣切口用生理鹽水紗布覆蓋持續(xù)60 min，然后局部撒青霉素粉2×105單位后關(guān)閉腹腔。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組和藥物治療方案

SD 大鼠72 只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組24 只。在構(gòu)建SCII 模型后記為0點(diǎn)，24 h 后設(shè)為1 d。分別在1 d、3 d、5 d 和7 d 這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)評估大鼠神經(jīng)功能及處死動物檢測相應(yīng)指標(biāo)。假手術(shù)組，大鼠后續(xù)不予任何處置;實(shí)驗(yàn)組，SCII 模型大鼠在構(gòu)建模型24 h 后給予腹腔注射10 mg/kg的人參皂甙Rb1，每天1 次，共7 d;實(shí)驗(yàn)對照組，相同時(shí)間點(diǎn)給予等體積生理鹽水腹腔注射。

1.5 評價(jià)方法

1.5.1 神經(jīng)功能評分

采用Basso Beattie-Bresnahan(BBB)運(yùn)動功能評分法［14］對3組模型進(jìn)行后肢神經(jīng)功能評分并記錄，滿分21 分，最低分0 分。

1.5.2 HE 染色

將脊髓組織固定于福爾馬林緩沖液中，無水酒精脫水后，石蠟包埋，橫斷面切成4 μm 薄片，蘇木精、伊紅染色，光鏡下觀察。

1.5.3 原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling technique，TUNEL)法染色

各組各時(shí)間點(diǎn)每只大鼠的連續(xù)切片中隨機(jī)抽取，做TUNEL 法染色。TUNEL 法染色過程如下:①石蠟切片，方法同HE 染色。②加入TUNEL 反應(yīng)液37 ℃孵育60 min，加入Converter-POD 37℃孵育30min，DAB 顯色，樹脂封片。

光學(xué)顯微鏡鏡下觀察凋亡細(xì)胞并計(jì)數(shù)，通過計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分比確定細(xì)胞凋亡情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料結(jié)果用±s 表示，組間各對應(yīng)指標(biāo)差異用方差分析，P＜0.05 為有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 BBB 評分

假手術(shù)組大鼠雙后肢BBB 評分為21 分。實(shí)驗(yàn)對照組BBB 評分顯著低于假手術(shù)組，隨著時(shí)間推移，后肢功能逐漸恢復(fù)，BBB 評分逐漸上升，但在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)仍低于假手術(shù)組，說明模型成功。實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)對照組比較可見BBB 的分值顯著增加(見圖1)。

2.2 HE 染色

病理切片HE 染色，光學(xué)顯微鏡觀察大鼠脊髓組織形態(tài)變化及細(xì)胞改變情況(見圖2)。假手術(shù)組組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生改變，神經(jīng)元大而多角，細(xì)胞核清晰居中，胞漿豐富。實(shí)驗(yàn)對照組部分神經(jīng)元受損，一些神經(jīng)元胞體膨大，結(jié)構(gòu)不清，可見細(xì)胞胞核固縮，組織間充血，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不清，部分可見凋亡小體。實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)對照組比較受損的神經(jīng)元數(shù)目減少，組織充血減輕。

2.3 TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡

圖1 各組大鼠后肢BBB 評分情況的比較Fig.1 BBB scores of rat hindlimbs in different groups

圖2 大鼠脊髓組織HE 染色(×400)Fig.2 HE staining of rat spinal cord tissues in 3 groups(×400)

圖3 各組大鼠脊髓組織TENUL 染色細(xì)胞凋亡情況(×400)Fig.3 TUNEL staining of rat spinal cord tissues in various groups(×400)

圖4 TUNEL 染色檢測各組大鼠脊髓細(xì)胞凋亡率Fig.4 Rate of cell apoptosis in various groups measured by tunnel staining

TUNEL結(jié)果(見圖3，4)顯示凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核固縮，顆粒深染，形態(tài)不規(guī)則。其中假手術(shù)組細(xì)胞凋亡較少，實(shí)驗(yàn)對照組的細(xì)胞凋亡率較高，給予人參皂甙Rb1 干預(yù)后，細(xì)胞凋亡率與實(shí)驗(yàn)對照組相比顯著降低(P＜0.05)。

3 討 論

SCII 是指在某種損傷因素作用下脊髓經(jīng)過一定時(shí)間缺血后得到血液再灌注后出現(xiàn)明顯的功能障礙，甚至出現(xiàn)不可逆性脊髓神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的現(xiàn)象，一直是神經(jīng)科學(xué)研究的難點(diǎn)之一。因此，保護(hù)脊髓神經(jīng)元，避免脊髓水腫，是治療SCII 的關(guān)鍵所在。有研究表明在多種動物模型上夾閉胸主動脈、腹主動脈可造成相應(yīng)節(jié)段的脊髓缺血，人體內(nèi)主動脈夾閉同樣會導(dǎo)致脊髓缺血的發(fā)生［15］。本研究中采用了肖博晗等［16］改進(jìn)的夾閉大鼠腹主動脈方法建立SCII 模型，實(shí)驗(yàn)技術(shù)成熟，操作簡便，損傷效果確實(shí)可靠。

SCII 的機(jī)制尚不明確，損傷過程可分為直接損傷和間接損傷，其發(fā)生、發(fā)展可能為多因素聯(lián)合作用。直接損傷主要發(fā)生在缺血過程中，再灌注損傷多為間接性損傷，間接損傷又稱為繼發(fā)性損傷，主要損傷因素為內(nèi)源性物質(zhì)的激活。相關(guān)研究認(rèn)為，氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、鈣離子超載、細(xì)胞凋亡、興奮性氨基酸釋放在SCII 中發(fā)揮了重要作用［17］。目前SCII 在臨床中的主要治療手段包括缺血預(yù)適應(yīng)，低溫、低流、低壓再灌注，藥物治療以及物理治療等［18-19］，但是都不能從根本上杜絕癱瘓的發(fā)生。而且這些治療方法只能以對癥支持為主，患者住院時(shí)間長，花費(fèi)大，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。

藥物治療方面，臨床上尚無明確有效的治療藥物。近年來有一些新型藥物相繼被報(bào)道有助于SCII神經(jīng)功能恢復(fù)，但治療后神經(jīng)功能改善效果均不確定，未見臨床廣泛應(yīng)用報(bào)道。目前在脊髓損傷早期，常用的藥物是糖皮質(zhì)激素，其可減輕炎癥反應(yīng)和脊髓損傷;而在脊髓損傷后期尚無安全有效的治療藥物，目前的相關(guān)研究熱點(diǎn)是應(yīng)用神經(jīng)再生因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子如神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)作為改善神經(jīng)功能或作為康復(fù)輔助用藥，但尚未取得明顯治療效果。因此，開發(fā)研制一種安全有效解決SCII 的藥物一直是臨床工作研究的重點(diǎn)之一。

近年來，我國學(xué)者嘗試將人參皂甙應(yīng)用到神經(jīng)系統(tǒng)疾病及損傷的治療中，發(fā)現(xiàn)人參皂甙在腦缺血、血管性癡呆、癲癇等疾病方面可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［20-21］。而目前國內(nèi)外文獻(xiàn)關(guān)于應(yīng)用人參皂甙治療SCII 的報(bào)道鮮見。因此，本研究利用大鼠SCII 模型深入研究了人參皂甙Rb1 對SCII 的保護(hù)效應(yīng)及其可能機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)顯示利用人參皂甙Rb1 干預(yù)SCII 模型大鼠，可顯著改善大鼠后肢功能，實(shí)驗(yàn)組的BBB 評分在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對照組。HE 染色光鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)明顯好于對照組。同時(shí)，TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率明顯少于對照組。以上結(jié)果提示人參皂甙Rb1 可改善SCII 大鼠的神經(jīng)功能，減輕SCII 導(dǎo)致的神經(jīng)元受損，減少脊髓細(xì)胞凋亡。具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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