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    高碘促成纖維細(xì)胞增殖作用與成纖維細(xì)胞生長因子及其受體的關(guān)系

    2013-11-01 06:23:40華淺近祖茂衡
    介入放射學(xué)雜志 2013年12期
    關(guān)鍵詞:隔膜纖維細(xì)胞生長因子

    華淺近, 祖茂衡, 滕 飛, 王 磊, 胡 琳

    我國布加-綜合征(Budd-Chiari syndrome,BCS)以下腔靜脈和(或)肝靜脈開口處隔膜阻塞型為主,其特征是下腔靜脈和(或)肝靜脈開口處隔膜形成,而隔膜的形成機(jī)制至今尚未明確[1]。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞為該隔膜主要構(gòu)成成分之一,隔膜組織中成纖維細(xì)胞生長因子受體 (fibroblast growth factor receptor,F(xiàn)GFR)的表達(dá)明顯高于正常血管壁組織[2]。此外,國內(nèi)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)BCS的發(fā)病率與飲用水中碘含量呈正相關(guān)[3],同時一定濃度的高碘培養(yǎng)環(huán)境能促進(jìn)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[4-5]。

    本研究以CCK-8檢測法[6]檢測FGFR抑制劑SU5402與適宜濃度碘離子共同作用下成纖維細(xì)胞的增殖情況,應(yīng)用免疫印跡法檢測不同濃度碘離子培養(yǎng)環(huán)境中成纖維細(xì)胞的堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (basic fibroblast growth factor,bFGF)、FGFR2 蛋白表達(dá)的情況,探討高碘促成纖維細(xì)胞增殖作用與bFGF、FGFR2的關(guān)系及與下腔靜脈隔膜形成的相關(guān)性。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞株培養(yǎng)

    HFL1人肺成纖維細(xì)胞(目錄號GNHu28)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。細(xì)胞培養(yǎng)于Corning培養(yǎng)皿中,采用F12K培養(yǎng)基(Sigma公司),加10%胎牛血清 (Gibco公司)。于37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),至細(xì)胞貼壁生長匯合即可傳代,每周傳代2次,選取第5~6代細(xì)胞用于實驗。

    1.2 細(xì)胞增殖檢測

    取對數(shù)生長期的成纖維細(xì)胞,胰酶消化后制成細(xì)胞懸液,用細(xì)胞計數(shù)板作細(xì)胞計數(shù),測定細(xì)胞密度,再用培養(yǎng)基稀釋至5×104個/ml。將細(xì)胞懸液接種至96孔板中,每孔約5 000個細(xì)胞,分為5組:①空白對照組 (每孔100 μl細(xì)胞懸液,20 μl F12K培養(yǎng)基); ② 溶媒組 (每孔 100 μl細(xì)胞懸液,19 μl F12K 培養(yǎng)基,1 μl DMSO); ③ KI組 (每孔 100 μl細(xì)胞懸液,15 μl F12K 培養(yǎng)基,5 μl KI);④ SU5402組(每孔 100 μl細(xì)胞懸液,15 μl F12K 培養(yǎng)基,5 μl SU5402);⑤ SU5402 和 KI共同作用組(每孔 100 μl細(xì)胞懸液,10 μl F12K 培養(yǎng)基,5 μl SU5402,5 μl KI)。以上各組均設(shè)6個復(fù)孔,其中③、⑤組的碘終濃度為1 000 μg/L,④、⑤組的SU5402終濃度為100 μmol/L。 隨后于 37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 h,更換新的F12K培養(yǎng)基,每孔再加入CCK-8 工作液(日本同仁)10 μl,孵育 40 min。 以F12K培養(yǎng)基加CCK-8工作液孔作為本底調(diào)零,于450 nmol/L波長處測定各孔吸光度(A)值,間接反映細(xì)胞數(shù)量,各組A值去除1個最高值和1個最低值。以上實驗重復(fù)3次。

    1.3 bFGF、FGFR2蛋白表達(dá)

    取對數(shù)生長期成纖維細(xì)胞1∶6傳代,培養(yǎng)48 h后換液,設(shè)空白對照組和碘離子組??瞻讓φ战M直接用F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)。碘離子組:在F12K培養(yǎng)基中分別加入碘化鉀,使碘離子終濃度分別為 250、500、1 000、2 000 和 3 000 μg/L,再將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中孵育12 h。采用Western印跡法檢測bFGF、FGFR2蛋白表達(dá)。用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,采用BCA法測蛋白濃度、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和免疫反應(yīng)。bFGF、FGFR2一抗(Abcam公司)均以1∶500稀釋,二抗稀釋比均為1∶1 000。顯色方法為5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/氯化硝基四氮唑藍(lán)(BCIP/NBT)發(fā)色顯色法。以上條帶均以β-actin作為內(nèi)參照。掃描后采用IPP6.0圖像分析軟件對特異性條帶進(jìn)行半定量分析,以 bFGF/β-acting,F(xiàn)GFR2/βacting的灰度值比值評定bFGF及FGFR2的蛋白表達(dá)水平。以上實驗重復(fù)3次。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

    采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),多個實驗組與1個對照組比較采用最小顯著差法(LSD),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 FGFR抑制劑對成纖維細(xì)胞增殖的影響

    空白對照組 (1.06±0.13) 與溶媒組 (1.02±0.11)間細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。KI組 (1.73±0.09)細(xì)胞增殖率明顯高于對照組,SU5402組(0.40±0.12)細(xì)胞增殖率明顯低于對照組,SU5402和KI共同作用組(1.18±0.10)細(xì)胞增殖率高于對照組,但低于KI組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)。

    2.2 不同碘濃度對bFGF、FGFR2蛋白表達(dá)的影響

    各碘濃度組與空白對照組比較,bFGF蛋白相對表達(dá)量差無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。500和1 000 μg/L碘濃度組FGFR2蛋白相對表達(dá)量較空白對照組明顯提高,且1 000 μg/L組明顯高于500 μg/L組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1、圖1~3。

    表1 不同濃度碘環(huán)境中bFGF、FGFR2蛋白相對表達(dá)量

    圖1 bFGF、FGFR2蛋白在各組中的表達(dá)

    圖2 不同碘濃度對bFGF蛋白相對表達(dá)量的影響

    圖3 不同碘濃度對FGFR蛋白相對表達(dá)量的影響

    3 討論

    3.1 高碘促成纖維細(xì)胞增殖的作用途徑

    國內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查顯示,隔膜型BCS患者分布地區(qū)的飲用水中碘含量超過正常標(biāo)準(zhǔn),并且BCS患者尿碘高于正常人,同時一定濃度的碘能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖[5]。bFGF是FGF家族中最具代表性的成員,它作為重要的促有絲分裂原對成纖維細(xì)胞有明顯的促增殖作用,能趨化血管內(nèi)膜的各類細(xì)胞并促進(jìn)其增殖和遷移,在損傷修復(fù)過程促進(jìn)細(xì)胞膠原酶的產(chǎn)生從而加速膠原分解,并通過促進(jìn)基底膜纖維的重新排布使基質(zhì)層纖維有序排布,達(dá)到減少瘢痕形成的作用[7]。FGFR是一類穿膜的酪氨酸激酶受體,介導(dǎo)FGF信號傳遞入細(xì)胞,分1~6個亞型,其中FGFR1、2為bFGF高親和力受體。FGF/FGFR途徑在細(xì)胞增殖和分化、創(chuàng)傷愈合和腫瘤細(xì)胞的分裂增殖中起重要作用[8]。

    本研究用的 SU5402是 2-[(1-2-二氫-2-氧代-3H-吲哚-3-亞基)甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-丙酸,能靶向作用于FGFRl激酶結(jié)構(gòu)域鉸鏈區(qū)的ATP結(jié)合位點,由于FGFR之間的結(jié)構(gòu)和序列相似,可通過與ATP結(jié)合而抑制FGFR2的磷酸化,從而也抑制FGFR2的活性[9-10]。本文結(jié)果顯示,KI組細(xì)胞增殖率明顯高于對照組,與劉小琴等[5]發(fā)現(xiàn)的碘離子濃度 ≤3 000 μg/L具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡作用的結(jié)果相符。而對于高碘促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的機(jī)制少見報道。騰飛等[11]在體外以高碘環(huán)境培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)碘離子促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并非通過提高血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受體(VEGFR)的蛋白表達(dá)量實現(xiàn),同時發(fā)現(xiàn)高碘能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞膜受體VEGFR-2(Tyr1214)磷酸化水平上調(diào)而介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移。血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均為BCS隔膜的主要成分,高碘培養(yǎng)環(huán)境能引起兩者的增殖,本研究以高碘對BCS隔膜另一主要成分的成纖維細(xì)胞增殖機(jī)制為切入點進(jìn)行研究,結(jié)果顯示SU5402組細(xì)胞增殖率明顯低于對照組,表明成纖維細(xì)胞增殖依賴于FGFR1和(或)FGFR2作用。SU5402聯(lián)合KI共同作用組細(xì)胞增殖率低于KI組,但仍高于對照組,表明高碘對成纖維細(xì)胞的促增殖作用不僅通過對FGF/FGFR途徑刺激實現(xiàn),還通過其他途徑實現(xiàn),具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

    3.2 高碘與bFGF、FGFR2蛋白表達(dá)的關(guān)系及意義

    FGFR2是bFGF的高親和力受體,在bFGF促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移過程中起至關(guān)重要的作用[7]。FGFR2與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),而被認(rèn)為是腫瘤治療的重要靶點,但其在血管內(nèi)隔膜形成過程中的作用尚少見報道。

    本研究的Western印跡結(jié)果顯示,碘濃度500和1 000 μg/L組的FGFR2蛋白表達(dá)明顯提高,且1 000 μg/L組明顯高于 500 μg/L組,提示高碘離子能促進(jìn)成纖維細(xì)胞FGFR2蛋白表達(dá)且呈濃度相關(guān)性。碘離子對成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡具有雙向效應(yīng),較低濃度的碘離子對成纖維細(xì)胞增殖起明顯的促進(jìn)作用,隨著碘離子濃度的升高促進(jìn)作用逐漸消失,碘離子濃度較高時成纖維細(xì)胞增殖活性受到抑制,高碘對成纖維細(xì)胞的作用呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系[5],本研究發(fā)現(xiàn)碘濃度 2 000 和 3 000 μg/L 組的FGFR2蛋白表達(dá)低于500和1 000 μg/L組,與空白對照組無明顯差異,說明高碘對成纖維細(xì)胞FGFR2蛋白表達(dá)的影響也存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。bFGF通過與其低親和力受體硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)結(jié)合,再通過HSPG結(jié)合到FGFR上。研究表明,2個FGFR2蛋白分子與1個HSPG分子結(jié)合,F(xiàn)GFR2的Y657位點發(fā)生二聚化,并發(fā)生自磷酸化而活化形成穩(wěn)定的二聚體[12]。FGFR2活化后可磷酸化成纖維細(xì)胞生長因子受體底物 2(FRS2)[13],募集生長因子受體結(jié)合蛋白2(GRB2),而后激活蛋白激酶C(protein kirmse C,PKC)、Ras/Raf/MEK/ERK 等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,通過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)功能。FGFR2蛋白表達(dá)量的提高將強(qiáng)化上述作用過程,導(dǎo)致包括成纖維細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞增殖條件發(fā)生紊亂,刺激細(xì)胞內(nèi)的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[14]。因此,高碘可能通過上調(diào)FGFR2蛋白表達(dá)量對成纖維細(xì)胞產(chǎn)生促增殖作用,而具體作用機(jī)制和激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還需深入研究。各碘濃度組成纖維細(xì)胞bFGF蛋白表達(dá)量無明顯差異,提示高碘促成纖維細(xì)胞增殖作用并非通過提高bFGF蛋白表達(dá)量實現(xiàn),高碘對HSPG、FRS2、GRB2蛋白表達(dá)及對bFGF降解膠原作用是否有影響還需進(jìn)一步證實。

    3.3 高碘與BCS隔膜組織形成的相關(guān)性

    目前研究發(fā)現(xiàn),我國隔膜型BCS病例的地理分布和水源性高碘地區(qū)分布基本相符,并且患者尿碘水平明顯高于正常人[3],這些研究均證實了BCS患者體內(nèi)外的高碘環(huán)境。近年發(fā)現(xiàn)高碘能刺激BCS隔膜主要成分之一的內(nèi)皮細(xì)胞膜受體VEGFR-2(Tyr1214)磷酸化水平上調(diào)而介導(dǎo)肌動蛋白重塑、張力纖維形成及VEC遷移。本研究發(fā)現(xiàn),高碘因素可提高FGFR2蛋白表達(dá)量并促進(jìn)其增殖,這與BCS隔膜組織檢測到增殖的成纖維細(xì)胞、高表達(dá)的FGFR結(jié)果相一致。我們推測由于肝靜脈開口處的血流切應(yīng)力、膈肌損傷等因素引起了肝靜脈開口處血管壁損傷[15],暴露出內(nèi)皮下層的血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞,而患者血液中高碘因素引起損傷處血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮細(xì)胞向管腔內(nèi)遷移,促進(jìn)BCS隔膜的形成。

    然而,不同類型BCS的發(fā)病機(jī)制不同,本研究主要針對隔膜阻塞型BCS的隔膜形成機(jī)制,而不能解釋以肝靜脈血栓、閉塞、狹窄形成為特點的單純肝靜脈病變型BCS發(fā)病機(jī)制,單純肝靜脈病變型BCS發(fā)病機(jī)制的研究主要針對血栓形成原因,如JAK2-V617F基因突變、凝血因子Ⅴ基因G1691A突變、紅細(xì)胞增多癥等[1]。此外,在體外高碘環(huán)境單一培養(yǎng)成纖維細(xì)胞無法模擬出動態(tài)變化的人體血液內(nèi)環(huán)境及隔膜的多種細(xì)胞及組織成分,本研究發(fā)現(xiàn)了高碘能上調(diào)FGFR2蛋白表達(dá)量,但具體作用機(jī)制和所激活的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還需深入研究。

    [1] Cheng D,Xu H,Lu ZJ,et al.Clinical features and etiology of Budd-Chiari syndrome in Chinese patients:a single-center study[J].J Gastroenterol Hepatol, 2013, 28: 1061-1067.

    [2] 白衛(wèi)星,李天曉,翟水亭,等.布-加綜合征隔膜組織病理學(xué)與相關(guān)因素研究[J].介入放射學(xué)雜志,2008,17:463-467.

    [3] 肖培瑞,藺新英,郭成浩,等.布-加綜合征分布與飲用水碘含量關(guān)系研究[J].環(huán)境與健康雜志, 2010, 27: 618-620.

    [4] 王曉磊,徐麗雅,張海濤,等.不同碘濃度對培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 [J].山東大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2007,45:310-312.

    [5] 劉小琴,郭成浩,張海濤,等.碘對成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡的影響[J].環(huán)境與健康雜志, 2010, 27: 568-570.

    [6] 王 濤,李冰晴,王津津,等.CCK-8檢測法研究槲皮素對人Tenon囊成纖維細(xì)胞的抑制作用 [J].眼科新進(jìn)展,2007,27:576-580.

    [7] Feng DF,Wang CY,Wang H,et al.bFGF-induced human periodontal ligament fibroblasts proliferation through t-type voltage-dependent Calcium channels [J].Acta Odontol Scand,2013, 71:9-14.

    [8] 伊海英,孫曉艷,付小兵,等.堿性成纖維細(xì)胞生長因子的研究進(jìn)展[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 33: 776-778.

    [9] Li M,F(xiàn)irth JD,Putnins EE.An in vitro analysis of mechanical wounding-induced ligand-independent KGFR activation [J].J Dermatol Sci, 2009, 53: 182-191.

    [10] Yamauchi K, Mizushima S, Tamada A, et al.FGF8 signaling regulates growth of midbrain dopaminergic axons by inducing semaphorin 3 F[J].J Neurosci, 2009, 29: 4044-4055.

    [11]滕 飛,祖茂衡,華淺近,等.血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖過程中碘離子與血管內(nèi)皮生長因子及其受體的關(guān)系 [J].介入放射學(xué)雜志,2013,22:403-408.

    [12]計 薇,孫文靖,張慧姝,等.人成纖維細(xì)胞生長因子受體2的研究進(jìn)展[J].國際遺傳學(xué)雜志, 2011, 34: 186-195.

    [13] Hadari YR, Gotoh N, Kouhara H, et al.Critical role for the docking-protein FRS2 alpha in FGF receptor-mediated signal transduction pathways [J].Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98:8578-8583.

    [14] Katoh Y, Katoh M.FGFR2-related pathogenesis and FGFR2-targeted therapeutics (Review)[J].Int J Mol Med, 2009, 23:307-311.

    [15]周恒根,徐 浩,祖茂衡,等.膈肌運動及血流動力學(xué)與下腔靜脈膜性阻塞關(guān)系的研究 [J].介入放射學(xué)雜志,2008,17:729-731.

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