順鉑誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡與自噬的研究

金鎮(zhèn)勛,蘭汝春,王 菲,董長(zhǎng)松，徐 冶

(吉林醫(yī)藥學(xué)院:1.附屬醫(yī)院消化科,2.醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013)

·論 著·

順鉑誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡與自噬的研究

金鎮(zhèn)勛1,蘭汝春1,王 菲1,董長(zhǎng)松1，徐 冶2*

(吉林醫(yī)藥學(xué)院:1.附屬醫(yī)院消化科,2.醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013)

目的探討順鉑對(duì)Hela細(xì)胞凋亡和自噬的影響。方法用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)觀察順鉑對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況； Hoechst 33342熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡；間接免疫熒光法檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3和P62的變化；免疫印記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2、Caspase-3和自噬標(biāo)志蛋白LC3和P62的變化。結(jié)果順鉑對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用表現(xiàn)為時(shí)間劑量依賴關(guān)系；順鉑作用Hela細(xì)胞導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值和Caspase-3表達(dá)增加，同時(shí)自噬標(biāo)志蛋白LC3和P62活化。結(jié)論順鉑誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡，伴有自噬發(fā)生。

順鉑;宮頸癌;凋亡;自噬

順鉑(cisplatin，DDP) 以及它的同類物被臨床廣泛用于治療多種惡性腫瘤，雖然具有一定的腎毒性和耳毒性，但還是取得了令人滿意的效果[1]。宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，順鉑作為首選化療藥物之一,其宮頸癌療效是肯定的；然而，目前對(duì)其作用機(jī)制還不十分清楚[2]。本研究以人宮頸癌HeLa細(xì)胞系為研究對(duì)象，觀察順鉑對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，對(duì)細(xì)胞凋亡和自噬的影響，探討順鉑抗宮頸癌的作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材 料

順鉑為山東齊魯制藥有限公司產(chǎn)品(批號(hào):705021CF)，用生理鹽水配制成1 000 μg/mL的儲(chǔ)存液，過(guò)濾除菌，4 ℃保存，用時(shí)以IMDM培養(yǎng)基(Gibco公司)稀釋至所需濃度；p62鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司、LC3兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Epotomics公司；Hoechst 33342熒光染料購(gòu)于北京鼎國(guó)公司；四甲基偶氮唑藍(lán)[3-(4，5-dimethy-2-thiazoly)-2，5-diphenyl-2-tet-razoliumbromide，MTT]購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌Hela細(xì)胞株由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系惠贈(zèng)，用含10%小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的IMDM培養(yǎng)基，青霉素和鏈霉素濃度均為100 U/mL，37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以5×104/mL密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組按DDP終濃度分為:1.5、3、4.5、6、12、18 μg/mL組；同時(shí)設(shè)單加培養(yǎng)液空白對(duì)照組和不加藥物作用陰性對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。藥物作用24 h或48 h時(shí)每孔加入MTT 20 μL，作用4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，Model 680型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)490nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度(OD)值。測(cè)3次，取平均值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(陰性對(duì)照組OD值- 空白組OD值)×100%。

1.4免疫印記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2、Caspase-3和自噬標(biāo)志蛋白LC3和p62

實(shí)驗(yàn)組(DDP 6 μg/mL處理6、12、24 h)及未加DDP的陰性對(duì)照組細(xì)胞消化收集于離心管中，加入細(xì)胞裂解液冰上靜置15 min，10 000 g離心15 min收集上清，Bradford法測(cè)蛋白濃度，-20 ℃?zhèn)溆谩?0%SDS-聚丙烯酰胺凝膠常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉、一抗4 ℃過(guò)夜，二抗2 h，DAB顯色，上海天能2500R凝膠成像儀照相分析。

1.5Hoechst 33342熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

高壓消毒后無(wú)菌蓋玻片置于24孔板中，取細(xì)胞密度1×105/mL，每孔500 μL接種過(guò)夜，次日細(xì)胞長(zhǎng)至80%密度，實(shí)驗(yàn)組加DDP 6 μg/mL處理24 h，同時(shí)設(shè)置未加DDP的陰性對(duì)照。棄去培養(yǎng)基，加入200 μL固定液(4%多聚甲醛)作用10 min，吸去固定液加0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液洗滌后，吸盡液體加200 μL Hoechst 33342染色液染色5 min，再用0.01 mol/L PBS溶液洗滌，抗熒光淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡觀察取圖。

1.6間接免疫熒光法檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3和p62

細(xì)胞爬片及給藥方法同上。爬片固定后經(jīng)0.1%TritonPBS作用5 min，0.01mol/L PBS溶液洗滌，非免疫山羊血清封閉30 min，加入預(yù)混的一抗4 ℃過(guò)夜，0.01mol/L PBS溶液洗滌，加入預(yù)混的熒光二抗作用30 min，0.01mol/L PBS溶液洗滌，抗熒光淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1DDP對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

順鉑對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性，藥物處理時(shí)間越長(zhǎng)，藥物濃度越高，順鉑對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率有明顯的增加趨勢(shì)(圖1)。

圖 1 MTT法檢測(cè)DDP對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

2.2DDP誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡蛋白、自噬蛋白表達(dá)

免疫印記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白和自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)，可見(jiàn)隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)為Bax/Bcl-2比值增高和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加；LC3II/LC3I比值增高而p62蛋白表達(dá)明顯下降(圖2)。

圖 2 Western Blot檢測(cè)凋亡蛋白Bax/Bcl-2、Caspase-3，自噬蛋白LC3、p62表達(dá)變化(*P<0.05 VS Control)

2.3DDP誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡、自噬的形態(tài)學(xué)改變

Hoechst 33342熒光染色顯示，活細(xì)胞所發(fā)熒光較弱且均勻，而經(jīng)DDP 6 μg/mL作用24 h后，部分Hela細(xì)胞核明顯變小，可見(jiàn)致密強(qiáng)熒光，有的呈顆粒狀或碎塊狀，為典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)(圖3A)。

間接免疫熒光法檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3和p62，對(duì)照組可見(jiàn)LC3和p62蛋白均呈散在分布，熒光較弱；實(shí)驗(yàn)組LC3和p62蛋白均呈聚集狀，有明顯的共定位，熒光較強(qiáng)(圖3B)。

圖 3 激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞凋亡、自噬(Bar=10μm)

3 討 論

順鉑是宮頸癌最常用的化療藥物之一，其殺傷腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制主要是能與DNA或蛋白質(zhì)形成交聯(lián)物，影響DNA的復(fù)制和修復(fù)，干擾了細(xì)胞的有絲分裂，抑制細(xì)胞增殖[3]。本研究中發(fā)現(xiàn)順鉑對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴效應(yīng)，隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率也明顯增加。在臨床應(yīng)用中，順鉑的腎毒性和耳毒性以及原發(fā)和繼發(fā)性的耐藥限制了它的使用[4]。

目前為止，雖然已經(jīng)開(kāi)展并獲得了一部分實(shí)驗(yàn)證據(jù)，但是順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制和腫瘤對(duì)其耐藥機(jī)制仍不清楚。本研究通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察到順鉑作用后Hela細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生明顯的凋亡，同時(shí)，免疫熒光結(jié)果顯示自噬標(biāo)志蛋白LC3和p62均被活化，呈現(xiàn)聚集狀態(tài)，且有明顯的細(xì)胞內(nèi)共定位。這提示順鉑誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡的同時(shí)伴有自噬的發(fā)生。進(jìn)一步的免疫印記結(jié)果顯示，凋亡蛋白Bax/Bcl-2比值增高和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加；自噬標(biāo)志蛋白LC3II/LC3I比值增高而p62蛋白表達(dá)明顯下降。這表明順鉑作用于Hela細(xì)胞觸發(fā)了Bcl-2家族介導(dǎo)的凋亡，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降，而促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，Bax/Bcl-2的比值增高，通過(guò)Caspase家族的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終活化了Caspase-3導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡[5]。

LC3蛋白是細(xì)胞自噬的標(biāo)志蛋白，其在自噬時(shí)由LC3I轉(zhuǎn)化為活化的LC3II，同時(shí)，結(jié)合p62蛋白并聚集于自噬體膜上，隨著自噬的進(jìn)展，p62蛋白也被溶酶體酶所降解，本研究結(jié)果與此一致[6]。表明順鉑作用于Hela細(xì)胞誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生。

順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬的機(jī)制及其與凋亡的關(guān)系都還沒(méi)有明確，已有研究結(jié)果顯示順鉑誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是調(diào)控這兩者的上游信號(hào)；也有研究表明，化療引發(fā)的自噬可能參與了腫瘤的耐藥[7-10]。因此，進(jìn)一步深入研究順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制，明確其誘導(dǎo)的自噬和凋亡的相互作用關(guān)系，以及自噬在腫瘤耐藥中的作用等，必將為臨床化療方案的選擇和藥物的開(kāi)發(fā)提供新的線索。

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CisplatininducedapoptosisandautophagyonhumancervicalcarcinomaHeLacells

JIN Zhen-xun1,LAN Ru-chun1,WANG Fei1,DONG Chang-song1,XU Ye2*

(1.Department of Gastroenterology,Affiliated Hospital,2.Medical Research Laboratory,Jilin Medical College,Jilin City,Jilin Province,132013,China)

ObjectiveTo investigate the apoptosis and autophagy inducing effect of Cisplatin on HeLa cells.MethodsMTT assay was employed to examine the growth suppression of the cells.Hoechst33342 staining was used to observe the apoptosis.Indirect immunofluorescence was used to detect the expressions and location of the LC3 and P62 proteins.Western Blotting was used to detect the expressions of Bax/Bcl-2,Caspase-3,LC3 and P62.ResultsThe inhibitory effect of Cisplatin was in a time and dosage dependant manner. Cisplatin could increase the ratio of Bax/Bcl-2 and expression of caspase-3.Cispaltin treatment induced activation of LC3 and P62.ConclusionCisplatin could induce apoptosis of HeLa cells paralleled autophagy.

Cisplatin;cervical cancer;apoptosis;autophagy

R737.33

A

2013-08-19)

1673-2995(2013)06-0401-04

吉林省科技廳資助項(xiàng)目(201015240),吉林省教育廳資助項(xiàng)目(2013361).

金鎮(zhèn)勛(1973-)，男(朝鮮族)，主治醫(yī)師，本科.

徐 冶(1972-)，男(漢族)，教授，博士.