膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑的研制及在煙草上的應(yīng)用

張愛民，張雙鳳，趙鋼勇，朱寶成，李淑娜

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北大學(xué) 生物技術(shù)中心，河北 保定 071002)

膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑的研制及在煙草上的應(yīng)用

張愛民1,2，張雙鳳2，趙鋼勇2，朱寶成1，李淑娜1

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北大學(xué) 生物技術(shù)中心，河北 保定 071002)

為研究膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑對煙草品質(zhì)的改善和產(chǎn)量的提高，通過自行分離的膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株的發(fā)酵、發(fā)酵液離心和后處理，研制出含菌量高達50.0×108/g的肥料制劑，并利用該肥料制劑在貴州煙草上進行了減少煙草專用肥的接種實驗.研究結(jié)果表明:每公頃施用該肥料制劑30 kg，能促進煙株生長發(fā)育，提高煙葉產(chǎn)量、產(chǎn)值、均價、上等煙葉率和中上等煙葉率，改善煙葉內(nèi)在化學(xué)品質(zhì)，大大提高煙葉質(zhì)量等級，同時底施該肥料制劑，還可減少20%的基肥施用，降低成本投入，增加煙農(nóng)的收益. 因此,該膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株在烤煙生產(chǎn)上具有一定的應(yīng)用價值.

膠凍樣類芽孢桿菌；肥料制劑；田間實驗；煙草

硅酸鹽細菌是一類能分解硅酸鹽礦物的細菌的俗稱，1912年蘇聯(lián)學(xué)者亞歷山羅夫[1]首先從蚯蚓腸道中分離出一株細菌，發(fā)現(xiàn)其能分解長石、云母、土壤礦物等鋁硅酸鹽類的原生態(tài)礦物，使土壤中難溶性K，P，Si等轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄晕镔|(zhì)供植物生長利用.1939年，研究人員直接從土壤中分離出這種細菌并命名為硅酸鹽細菌(Silicatebacterium)[2].Alexandrov也報道，從巖石材料中分離出一株產(chǎn)黏液的能分解硅酸鹽的細菌，并定名為膠質(zhì)芽孢桿菌硅酸鹽亞種(Baci11usmuci1aginosussubsp.si1iceus),但限于當時的條件未對其作進一步研究.因此該種的分類地位長期以來未得到國際承認.

1993年，研究人員經(jīng)過對芽孢桿菌屬51株菌種的16S rDNA序列測定和比較分析，將其分類命名為類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)[3].類芽孢桿菌屬的菌株分布廣泛，可以從土壤、水和不同的植物根際和植物體內(nèi)分離得到[4-5],該屬菌株的重要特點是大多產(chǎn)生具有拮抗作用二級代謝產(chǎn)物[6],膠凍樣類芽孢桿菌也歸為該屬.但是該菌株不僅具有以上特點，同時還具有解鉀、解磷、固氮等多種作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用可以提高作物產(chǎn)量，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)[7].

由于膠凍樣類芽孢桿菌能夠分解含鉀硅酸鹽礦物，因此以此菌株為主要活性成分俗稱為生物鉀肥的產(chǎn)品已在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用.中國20世紀50年代推廣使用的硅酸鹽細菌制劑(生物鉀肥)曾帶來了良好的增產(chǎn)效果.該菌株在原蘇聯(lián)也進行了廣泛研究.近年來，國內(nèi)大量田間實驗表明生物鉀肥對各種喜鉀作物如甘薯、煙草、水稻等有明顯的增產(chǎn)作用[8-9].

硅酸鹽細菌菌劑一直采用傳統(tǒng)工藝制造，限制了該項技術(shù)的推廣和應(yīng)用.本文采用新分離的膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株，通過發(fā)酵、離心和噴霧干燥工藝處理，并與草炭載體復(fù)配，研制出了含菌量高達50.0×108/g的肥料制劑.應(yīng)用該制劑在中國煙草主產(chǎn)區(qū)貴州省的煙草上進行了大田對比實驗，實驗結(jié)果表明:施用該肥料制劑可減少傳統(tǒng)煙草種植模式專用肥的用量，并可提高煙草產(chǎn)量，改善煙草品質(zhì).

1 材料和方法

1.1供試菌種

膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)研究室分離保藏.菌株分離自陜西小麥田.

1.2供試作物

煙草品種-云87，為貴州省目前主要栽培品種.

1.3培養(yǎng)基

1.3.1 斜面培養(yǎng)基(g/L)

酵母粉7.0，酵母膏0.7，蛋白凍10.0，糊精2.0，磷酸氫二鈉1.0，硫酸鋅0.2，硫酸鈣0.2，瓊脂20.0.

1.3.2 種子培養(yǎng)基(g/L)

蔗糖10.0，硫酸銨1.0，磷酸氫二鉀2.0，酵母膏0.4，硫酸錳2.0，醋酸鈣 1.0，三氯化鐵0.2，pH 7.0～7.2.

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)

磷酸氫二鉀2.0，蔗糖20.0，硫酸錳2.0，硫酸銨0.8，醋酸鈣1.5，酵母膏0.5，pH 7.0～7.2.

1.4膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑的研制

1.4.1 菌種的活化

將膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株保存菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h.

1.4.2 種子培養(yǎng)

250 mL三角瓶中分裝種子培養(yǎng)基，121 ℃，30 min滅菌，冷卻至室溫后接種膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株菌種，恒溫搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，周期14～18 h.

種子含菌量的測定方法(血球計數(shù)板法)：取培養(yǎng)(發(fā)酵)到終點的培養(yǎng)液1.0 mL，加到含有9.0 mL無菌水的試管中，充分振蕩1 min，再按照同樣方法加到第2支試管中，充分振蕩1 min后，用滴管加到血球計數(shù)板計數(shù)室內(nèi)，沉淀片刻后，在顯微鏡高倍鏡下數(shù)5個中方格的菌體數(shù)量計數(shù)，則培養(yǎng)液的含菌量按如下公式計算：

含菌量=(5個中方格菌數(shù)之和)÷5÷4×108/mL.

1.4.3 發(fā)酵實驗

用50 L全自動發(fā)酵罐進行實驗，培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，裝料系數(shù)為70 %，121 ℃滅菌 30 min，冷卻至室溫后，負壓法接種液體菌種.

發(fā)酵液含菌量的測定方法(活菌計數(shù)法)：分別吸取5.0 mL發(fā)酵液加入45 mL無菌水中，按體積比1∶10進行梯度稀釋，分別得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7稀釋度的菌懸液.然后每個樣品取3個連續(xù)適宜的稀釋度，用0.5 mL無菌移液管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1 mL，均勻地涂布于檢測培養(yǎng)基平板上.每一稀釋度重復(fù)3次，同時以無菌水作空白對照，32 ℃培養(yǎng) 48 h，以出現(xiàn)20～300個菌落數(shù)的稀釋度的平板為計數(shù)標準，分別統(tǒng)計有效活菌數(shù).

含菌量(/mL)=(3個平板菌落數(shù)之和)÷3×10×稀釋倍數(shù).

1.4.4 CX-9菌株肥料制劑的制備及質(zhì)量檢測[10]

將CX-9菌株3批次發(fā)酵的發(fā)酵液收集在一個容器中，稱重后離心，然后進行噴霧干燥.計數(shù)后與適量草炭混合，研制出高含菌量的肥料制劑.依據(jù)GB20287-2006《農(nóng)用微生物菌劑》進行產(chǎn)品檢驗.

肥料制劑生物量的測定方法(平板計數(shù)法)：準確稱取10.0 g肥料制劑加入100 mL無菌水中，按體積比1∶10進行梯度稀釋，分別得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7稀釋度的菌懸液.然后每個樣品取3個連續(xù)適宜的稀釋度，用0.5 mL無菌移液管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1 mL，均勻地涂布于檢測培養(yǎng)基平板上.每一稀釋度重復(fù)3次，同時以無菌水作空白對照， 32 ℃培養(yǎng)48 h，以出現(xiàn)20～300個菌落數(shù)的稀釋度的平板為計數(shù)標準，分別統(tǒng)計有效活菌數(shù).

生物量(/g)=(3個平板菌落數(shù)之和)÷3×10×稀釋倍數(shù).

1.5CX-9菌株肥料制劑在煙草上的應(yīng)用效果

1.5.1 試驗地基本情況

試驗在貴州龍崗煙草綜合實驗區(qū)內(nèi)進行，質(zhì)地黏壤，有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)2.78%，pH值6.12，堿解氮38.52 mg/kg，速效磷32.82 mg/kg，速效鉀108.36 mg/kg，肥力中上等，前茬為水稻.

1.5.2 試驗設(shè)計

采用同田簡單對比設(shè)計，設(shè)2個處理，3次重復(fù).實驗面積0.4 hm2，外設(shè)保護行.T(接種)：CX-9菌株肥料制劑+4/5常規(guī)烤煙專用基肥；CK(對照)：常規(guī)烤煙專用基肥(N,P2O5,K2O的質(zhì)量分數(shù)分別為10%,15%,15%), 對照和接種的肥料用量見表1.接種方法為用打洞器移栽，將CX-9菌株肥料制劑和300 kg干細土混合均勻后放在打洞器底部均勻施到每株煙草穴底部，然后放上煙苗即可.煙草追肥肥料N,P2O5,K2O的質(zhì)量分數(shù)分別為10%,10%,20%.種植密度為16 500株/hm2，行距110 cm，株距55 cm.

表1 各處理肥料用量

1.5.3 物候期的調(diào)查及觀測

觀察記載各處理烤煙的團棵期、現(xiàn)蕾期和打頂期；測定各處理在團棵期和旺長期的株高、莖圍、出葉數(shù)、最大葉長和葉寬；收獲時分別計產(chǎn).

1.5.4 田間管理

起壟、施肥、移栽、病蟲害防治、中耕、培土上廂、打頂和采烤等按當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)方案執(zhí)行.

1.5.5 煙葉的化學(xué)成分分析

分別取各處理中部煙葉(C3F)和上部煙葉(B2F)進行化學(xué)成分分析.

2 結(jié)果與分析

2.1CX-9菌株肥料制劑的研制

2.1.1 菌種的活化和轉(zhuǎn)接

將膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株的保藏菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2 d，斜面表面變成白色，涂片后，在顯微鏡下觀察，菌體全部變成芽孢，4 ℃冰箱保存.

2.1.2 種子培養(yǎng)

將膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12～14 h，取樣鏡檢，菌體成對或單個排列，菌體粗壯，結(jié)晶紫染色均勻，pH 6.0～6.3.計數(shù)含菌量為2.4×108/mL.

2.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

將膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株種子培養(yǎng)液，以負壓法按7%接種量接種到50 L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為：溫度35～37 ℃，罐壓0.06 MPa，間歇攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min，通風(fēng)比為1∶(0.3～0.5)(隨時間而變化)，發(fā)酵周期36～40 h，并進行同步化驗分析，pH值采用在線pH電極測定，含菌量采用稀釋平板法測定，結(jié)果見表2.

表2 膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株3批次發(fā)酵實驗結(jié)果

結(jié)果表明，膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株在50 L發(fā)酵罐發(fā)酵，3批次結(jié)果比較一致，平均含菌量達到7.8×108/mL，芽孢形成率在95%以上，發(fā)酵水平較高.

2.1.4 膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑的檢驗結(jié)果

將3批發(fā)酵液收集后離心，并進行噴霧干燥，測定芽孢菌粉的生物量為602.4×108/g，將菌粉和草炭按照質(zhì)量比11∶1進行充分混合，研制出草炭為載體的膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑，按照GB20287-2006《農(nóng)用微生物菌劑》所規(guī)定的方法進行相關(guān)項目的質(zhì)量檢測，結(jié)果見表3.

表3 CX-9菌株肥料制劑的檢驗結(jié)果

從表3看出，采用草炭為載體制成的膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑成品的含菌量遠遠高于GB20287-2006《農(nóng)用微生物菌劑》所規(guī)定的技術(shù)指標，說明本生產(chǎn)工藝流程生產(chǎn)的肥料制劑符合農(nóng)業(yè)部微生物肥料質(zhì)量標準所規(guī)定的的技術(shù)指標，肥料制劑的研制方法可行.

2.2膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑在煙草上的應(yīng)用效果

2.2.1 各處理對烤煙生育期的影響

接種膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑對烤煙生育期的影響不大，對照與接種處理的煙株均于5月8日移栽，6月10日進入團棵期，7月5日進入現(xiàn)蕾期，7月12日進入打頂期.

2.2.2 膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑對烤煙團棵期煙株農(nóng)藝性狀的影響

煙草生長到團棵期時進行相關(guān)農(nóng)藝性狀的調(diào)查和統(tǒng)計，結(jié)果見表4.

表4 各處理團棵期煙株農(nóng)藝性狀比較

表中數(shù)據(jù)均為5株的平均值.n=4時，t0.05=7.709,t0.01=21.98.

從表4得知，接種膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑的煙草株高較對照平均高0.4 cm，葉片數(shù)較對照平均多1.0片/株，莖圍較對照粗1.0 cm，葉面積較對照增加113.65 cm2.其中對構(gòu)成煙草產(chǎn)量的主要因素株高和葉面積進行了生物統(tǒng)計，t株高=19.267>t0.05=7.709，說明接種(T)與對照(CK)間達到顯著性差異；t葉面積=23.947 7>t0.01=21.98 ，說明接種與對照間達到極顯著性差異. 因而烤煙施用該膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑，能促進煙株前期生長發(fā)育.

2.2.3 膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑對烤煙旺長期煙株農(nóng)藝性狀的影響

煙株生長到旺長期時進行相關(guān)農(nóng)藝性狀的調(diào)查和統(tǒng)計，結(jié)果見表5.

表5 旺長期各處理煙株農(nóng)藝性狀比較

從表5看出，烤煙施用膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑后，烤煙的株高、葉片數(shù)、莖圍和最大葉葉面積均好于對照.煙株株高較對照多1.6 cm，煙株葉片數(shù)較對照多2.0片/株，莖圍較對照多0.7 cm. 其中對構(gòu)成煙草產(chǎn)量的主要因素株高和葉面積進行了生物統(tǒng)計，t株高=19.267>t0.05=7.709，說明接種(T)與對照(CK)間株高達到顯著性差異；t葉面積=23.947>t0.01=21.98 ，說明接種與對照間葉面積達到及顯著性差異,為煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的提高奠定了基礎(chǔ).

2.2.4 膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑對烤煙產(chǎn)量和產(chǎn)值的影響

煙葉收獲后，進行產(chǎn)量和產(chǎn)值統(tǒng)計，并分析了上中等煙所占比例，結(jié)果見表6.

表6 不同處理對烤煙產(chǎn)值的影響

從表6可見，接種CX-9菌株肥料制劑煙葉產(chǎn)量為2 187 kg/hm2，較對照(CK)高147 kg/hm2， 煙葉產(chǎn)值較對照高4 711.5元/hm2， 煙葉均價、上等煙率和中上等煙率分別較對照(CK)高18元/kg、7.0%和8.3%. 因而煙草施用膠凍樣類芽孢桿菌肥料制劑可以提高煙草種植的經(jīng)濟效益.

2.2.5 不同處理對煙葉化學(xué)成分的影響

煙葉收獲后，分別取C3F葉片和B2F葉片，送貴州省煙草所進行相關(guān)化學(xué)成分的分析測定，結(jié)果見表7.

表7 不同處理對煙葉化學(xué)成分的影響

煙葉的化學(xué)成分是煙葉香味風(fēng)格和品質(zhì)特性形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，煙葉香味風(fēng)格是煙葉內(nèi)在化學(xué)成分平衡的綜合體現(xiàn)[11]. 煙堿是影響煙葉品質(zhì)的重要因素之一，優(yōu)質(zhì)煙葉要保證一定的煙堿含量[12]. 總氮質(zhì)量分數(shù)一般為1.5%～3.5%，以2.5%最佳，適宜的氮堿質(zhì)量比最好接近1.0. 還原糖對煙葉品質(zhì)起平衡作用，一般要求質(zhì)量分數(shù)為16%～22%[13].煙葉氯質(zhì)量分數(shù)以0.3%～0.8%為宜[14-15]，煙葉含氯量增加，糖類代謝受阻，淀粉積累過多.

煙葉的內(nèi)在質(zhì)量是判斷煙葉質(zhì)量好壞的主要依據(jù)，主要包括香氣、雜氣、吃味、勁頭、刺激性、濃度、余味等.根據(jù)國內(nèi)優(yōu)質(zhì)煙葉的評價，質(zhì)量好的煙葉樣品應(yīng)還原糖含量較高，總氮含量較低，煙堿含量適中，K2O含量較高，兩糖差值小，蛋白質(zhì)含量較低，糖堿比、鉀氯比、氮堿比均較高.

從還原糖上看，C3F處理(T)較對照高8.88%，B2F處理(T)較對照(CK)高1.39%，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的還原糖含量均高于對照.

從總氮上看，C3F總氮處理(T)較對照低0.57%，B2F總氮處理(T)較對照(CK)低1.06%，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的總氮含量均低于對照.

從煙堿含量上看，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的煙堿含量均有所降低，但比較適宜，符合優(yōu)質(zhì)煙葉的煙堿范圍.

從K2O含量上分析，C3F處理(T)較對照高0.56%，B2F處理(T)較對照(CK)高0.11%，因而施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的K2O含量均高于對照.

從糖堿質(zhì)量比、鉀氯質(zhì)量比和氮堿質(zhì)量比上看，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的三者比值均比對照高，因而煙葉品質(zhì)較好.

從以上5項優(yōu)質(zhì)煙葉的評價上看，施用CX-9肥料制劑可明顯提高煙葉的內(nèi)在質(zhì)量.

3 結(jié)論

將膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株進行發(fā)酵、離心及干燥處理研制出含菌量高達50.0×108/g的高生物量菌粉(肥料制劑)，高于GB20287-2006《農(nóng)用微生物菌劑》所規(guī)定的技術(shù)指標，證明該生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的肥料制劑路線可行.

在煙草上施用膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑，可減少20%的煙草專用基肥用量，盡管對烤煙進入各個生育期的時間影響差異不大，但能促進煙株生長發(fā)育，對提高煙葉產(chǎn)量、產(chǎn)值、均價、上等煙葉率和中上等煙葉率的作用明顯. 從還原糖上看，C3F處理(T)較對照高8.88%，B2F處理(T)較對照(CK)高1.39%，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的還原糖含量均高于對照；從總氮上比較，C3F處理(T)較對照低0.57%，B2F處理(T)較對照(CK)低1.06%，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的總氮含量均低于對照；從煙堿含量上看，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的煙堿含量均有所降低，但比較適宜，符合優(yōu)質(zhì)煙葉的煙堿范圍；從K2O含量上分析，C3F處理(T)較對照高0.56%，B2F處理(T)較對照(CK)高0.11%，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的K2O含量均高于對照；從糖堿比、鉀氯比和氮堿比上分析，施用CX-9肥料制劑的C3F和B2F的三者比值均比對照高，因而煙葉品質(zhì)較好.從以上5項優(yōu)質(zhì)煙葉的評價上看，施用CX-9肥料制劑可明顯提高煙葉的內(nèi)在質(zhì)量.

該肥料制劑對于提高煙草品質(zhì)的的作用機理有待進一步探討.

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ApplicationintobaccoandpreparationofthefertilizeragentofPaenibacillusmucilaginosusCX-9strain

ZHANGAimin1,2,ZHANGShuangfeng2,ZHAOGangyong2,ZHUBaocheng1,LIShuna1

(1.College of Life Science, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001,China;

2.Center of Biological Technology，Hebei University，Baoding 071002,China)

In order to study the improving of tobacco quality and increasing of tobacco yield byPaenibacillusmucilaginosusCX-9 strain, a kind of fertilizer agent has been produced. The fertilizer agent was get by fermentation, centrifugation and drying process ofP.mucilaginosusCX-9 strain and its biological amount can be reached to 50.0×108/g. The application experiments to reduce tobacco specific fertilizer were carried on in tobacco field in Guizhou province. As a result, with the application of 30 kg per hectare, the fertilizer agent had the ability of promoting tobacco plant growth, despite of this, the tobacco yield, production value, average price of tobacco leaf and rate of superior tobacco were promoted, and tobacco internal quality of chemistry were improved. Meanwhile, application of it could reduce tobacco basic fertilizer application 20%. So the costs of farmers could be reduced directly, and the income could be increased. Therefore, the application of fertilizer agent ofP.mucilaginosusCX-9 strain in tobacco planting have certain value-in-use.

Paenibacillusmucilaginosus; fertilizer agent; field experiments; tobacco

10.3969/j.issn.1000-1565.2013.04.010

2012-09-12

河北省科技支撐項目(06207125D-2)

張愛民(1967-)，男，河北武邑人，河北大學(xué)研究員,河北農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀博士，主要從事農(nóng)業(yè)微生物及土壤修復(fù)劑的研究.E-mail:zhangam2008@yahoo.com.cn

Q93

A

1000-1565(2013)04-0387-07

(責(zé)任編輯趙藏賞)