分散固相萃取-氣相色譜法測(cè)定茶葉中25種有機(jī)氯與擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留

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(1中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院，北京100020；2.北京市營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100020)

茶葉是我國(guó)傳統(tǒng)的農(nóng)產(chǎn)品，其生產(chǎn)面積和總產(chǎn)量均居世界第一[1]。近年來(lái)，歐盟、日本等茶葉進(jìn)口國(guó)家對(duì)茶葉制定了嚴(yán)苛的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，農(nóng)藥殘留檢測(cè)項(xiàng)目不斷增多，最大殘留限量大幅降低，茶葉的質(zhì)量安全已成為我國(guó)茶葉出口的“綠色壁壘”[2]。2013年3月1日，《GB 2763-2012 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》正式實(shí)施，新國(guó)標(biāo)中涉及茶葉的最大農(nóng)藥殘留限量品種增加到25種，因此建立茶葉中多種農(nóng)藥同時(shí)分析的方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。有機(jī)氯農(nóng)藥是人工合成的含氯有機(jī)化合物，主要包括以苯為原料和以環(huán)戊二烯為原料合成的兩類化合物，有機(jī)氯農(nóng)藥毒性強(qiáng)、不易分解，我國(guó)自1983年起已全面禁用六六六、滴滴涕等有機(jī)氯殺蟲劑[3]。擬除蟲菊酯農(nóng)藥屬于仿生性殺蟲劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與天然除蟲菊素類似[3]。由于其具有高效低毒等特性，在我國(guó)茶園中得到廣泛應(yīng)用，造成菊酯類農(nóng)殘現(xiàn)象較為普遍。

文獻(xiàn)中已報(bào)道的提取與凈化方法有微波輔助萃取-固相微萃取[4]、直接懸掛液滴微萃取[5]、攪拌棒吸附萃取[6]、固相萃取[7-10]、QuEChERS[11]、加速溶劑萃取-凝膠滲透色譜[12]、亞臨界水萃取[13]，檢測(cè)方法有氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器(GC-ECD)[4-8,10,12]、液相色譜(HPLC)[9]、氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)[7,12,14]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC/MS/MS)[13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS/MS)[11]。固相萃取提取效率高，但操作繁瑣、溶劑用量大且SPE柱成本較高；微波輔助萃取、加速溶劑萃取和凝膠滲透色譜等方法自動(dòng)化程度高，但儀器投入較大、對(duì)操作人員也提出較高要求；質(zhì)譜靈敏度高、可提供化合物的結(jié)構(gòu)信息，在農(nóng)殘分析研究中已廣泛應(yīng)用，但質(zhì)譜儀器昂貴、運(yùn)行及維護(hù)成本較高，不適合基層企業(yè)日常檢驗(yàn)使用。茶葉生產(chǎn)企業(yè)在對(duì)原料及產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留量監(jiān)控過(guò)程中，需要對(duì)大量的樣品進(jìn)行處理和檢測(cè)，因此，簡(jiǎn)單快速的分散固相萃取前處理技術(shù)結(jié)合高靈敏度低成本的氣相色譜方法成為茶葉企業(yè)檢測(cè)有機(jī)氯與擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的首選方法。本研究通過(guò)乙腈超聲提取，石墨化炭黑(GCB)和乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)分散固相萃取凈化，結(jié)合GC-ECD檢測(cè)茶葉中25種有機(jī)氯與擬除蟲菊酯農(nóng)藥的殘留量，建立了一個(gè)適合于企業(yè)質(zhì)量控制的農(nóng)殘檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GC-2010Plus氣相色譜儀(配ECD檢測(cè)器，日本島津公司)，TG 16-II臺(tái)式高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司)，BSA 224S-CW電子天平(德國(guó)賽多利斯集團(tuán))，SB-3200 DTDN超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，HGC-24A氮吹儀(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)，QL-902旋渦混合器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：α-六六六(α-BHC)、β-六六六(β-BHC)、γ-六六六(γ-BHC)、δ-六六六(δ-BHC)、七氯(Heptachlor)、艾氏劑(Aldrin)、o,p’-滴滴滴(o,p’-DDD)、o,p’-滴滴伊(o,p’-DDE)、o,p’-滴滴涕(o,p’-DDT)、p,p’-滴滴滴(p,p’-DDD)、p,p’-滴滴伊(p,p’-DDE)、p,p’-滴滴涕(p,p’-DDT)、α-硫丹(α-Endosulfan)、β-硫丹(β-Endosulfan)、硫丹硫酸酯(Endosulfan-sulfate)、聯(lián)苯菊酯(Bifenthrin)、甲氰菊酯(Fenpropathrin)、高效氯氟氰菊酯(Cyfluthrin)、氯菊酯(Permethrin)、λ-氯氰菊酯(Cyhalothrin)、氟氰戊菊酯(Flucythrinate)、高效氰戊菊酯(Esfenvalerate)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、三氯殺螨砜(Tetradifon)、噠螨靈(Pyridaben)(純度在87.0～99.6%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)。石墨化炭黑(GCB)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)(北京BESEP公司)。乙腈、正己烷、石油醚、丙酮、甲苯(色譜純，美國(guó)Fisher公司)。

茶葉樣品購(gòu)自市場(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

精確稱取25種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲苯-丙酮混合溶液配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃條件下儲(chǔ)存。

混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：根據(jù)25種農(nóng)藥在儀器上的響應(yīng)值分別準(zhǔn)確移取各種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品適量，用正己烷配制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃冰箱中保存，使用時(shí)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行稀釋。

1.2.2 樣品前處理

粉碎：取茶葉樣品100 g，粉碎機(jī)粉碎，用圓孔篩篩出≤2.0 mm顆粒。混勻，裝入潔凈容器內(nèi)，密封，冷藏保存。提取：將2.50 g(精確至0.01 g)干茶葉粉末，于50 mL離心管中加入10 mL乙腈，超聲提取20 min，于3000 r/min離心5 min。凈化：取一支10 mL離心管，加入30 mg GCB、40 mg PSA吸附劑，轉(zhuǎn)入上述上清提取液1.5 mL，渦旋混合3 min，于6000 r/min離心3 min，取出上清液0.8 mL，氮吹近干后以正己烷復(fù)溶至0.8 mL，過(guò)0.22 μm尼龍濾膜，待GC-ECD分析。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：DB-35ms毛細(xì)管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；恒線速率模式，初始流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口：分流進(jìn)樣，分流比10∶1，溫度280 °C，進(jìn)樣量1 μL；升溫程序：150 °C保持2 min，10 °C /min升至300 °C，保持30 min；載氣：N2，純度≥99.999%；ECD檢測(cè)器：溫度320 °C。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

大部分有機(jī)氯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的極性較小，因此色譜柱優(yōu)化實(shí)驗(yàn)選用適合分析非極性與弱極性化合物的Rtx-1、DB-5MS和DB-35MS三種毛細(xì)管色譜柱，規(guī)格均為30 m×0.25 mm×0.25 μm。

結(jié)果表明，Rtx-1對(duì)聯(lián)苯菊酯和甲氰菊酯沒有達(dá)到有效分離；DB-5MS和DB-35MS對(duì)25種農(nóng)藥均有較好的分離能力，由于DB-35MS具有更好的耐高溫性能，可在檢測(cè)時(shí)通過(guò)設(shè)置更高的柱箱溫度凈化色譜柱，降低基線升高對(duì)下一次分析造成的干擾，適用于多次連續(xù)進(jìn)樣。因此本實(shí)驗(yàn)選擇DB-35MS作為色譜柱。

2.2 提取劑的選擇

茶葉基質(zhì)復(fù)雜且同時(shí)提取25種農(nóng)藥，數(shù)量較多，極性也存在一定差異，因此實(shí)驗(yàn)選擇了乙腈、石油醚、正己烷-丙酮(V∶V=9∶1)三種提取劑進(jìn)行優(yōu)化。

研究表明：如圖1所示，石油醚對(duì)5種農(nóng)藥的加標(biāo)回收情況不理想，β-六六六和δ-六六六的回收率小于30%；正己烷-丙酮和乙腈對(duì)大多數(shù)農(nóng)藥有較好的回收率，可以滿足實(shí)驗(yàn)要求，但丙酮對(duì)茶葉中的雜質(zhì)提取較多，在色譜圖上雜質(zhì)峰干擾嚴(yán)重、基線較差，無(wú)法滿足分析檢測(cè)需求；乙腈極性大、穿透性強(qiáng)，適合多農(nóng)藥殘留的提取。因此，選擇乙腈作為提取劑。

圖1 3種提取劑對(duì)部分農(nóng)藥回收率的影響

2.3 提取方式的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了搖床搖動(dòng)、手動(dòng)振蕩+渦旋和超聲3種提取方式。

3種提取方式中，搖床搖動(dòng)需要1小時(shí)，提取時(shí)間較長(zhǎng)，不適合企業(yè)的高通量分析；手動(dòng)振蕩3 min+渦旋1 min時(shí)間短強(qiáng)度大，但是平行操作的誤差較大，回收率不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性差；超聲提取20 min條件下，大部分農(nóng)藥具有較好的回收率，見圖2。因此選擇超聲20 min作為茶葉中有機(jī)氯和擬除蟲菊酯的提取方式。

2.4 吸附劑用量的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了GCB在5～30 mg和PSA在0～50 mg之間的用量。

GCB對(duì)茶葉中大量的色素有很強(qiáng)的去除能力，但同時(shí)也對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生一定的吸附力，所以GCB的用量不宜太大；PSA有兩個(gè)氨基，能去除植物基質(zhì)中的有機(jī)酸、金屬離子、多酚類物質(zhì)和一部分色素。通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)GCB為30 mg、PSA為40 mg的用量時(shí)，除p,p’-DDT以外的大部分農(nóng)藥均具有較高的回收率，見圖3與圖4。

圖2 超聲提取條件下25種農(nóng)藥的回收率1.α-BHC、2.γ-BHC、3.β-BHC、4. 七氯、5.δ-BHC、6. 艾氏劑、7.o,p’-DDE、8.α-硫丹、9.p,p’-DDE、10.o,p’-DDD、11.o,p’-DDT、12.p,p’-DDD、13.β- 硫丹、14. p,p’-DDT、15. 聯(lián)苯菊酯、16. 硫丹硫酸酯、17. 甲氰菊酯、18.高效氯氟氰菊酯、19. 三氯殺螨砜、20. 氯菊酯、21. 噠螨靈、22. 氯氰菊酯、23. 氟氰戊菊酯、24. 高效氰戊菊酯、25. 溴氰菊酯

圖3 不同GCB用量對(duì)25種農(nóng)藥回收率的影響1.α-BHC、2.γ-BHC、3.β-BHC、4. 七氯、5.δ-BHC、6. 艾氏劑、7.o,p’-DDE、8.α-硫丹、9.p,p’-DDE、10.o,p’-DDD、11.o,p’-DDT、12.p,p’-DDD、13.β- 硫丹、14. p,p’-DDT、15. 聯(lián)苯菊酯、16. 硫丹硫酸酯、17. 甲氰菊酯、18.高效氯氟氰菊酯、19. 三氯殺螨砜、20. 氯菊酯、21. 噠螨靈、22. 氯氰菊酯、23. 氟氰戊菊酯、24. 高效氰戊菊酯、25. 溴氰菊酯

2.5 工作曲線、線性范圍及檢出限的測(cè)定

配制25種農(nóng)藥的混標(biāo)工作液，以峰面積對(duì)濃度做工作曲線，結(jié)果見表1。在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)，各農(nóng)藥的響應(yīng)值與濃度具有良好的線性關(guān)系。以S/N=3計(jì)算方法檢出限。25種有機(jī)氯和擬除蟲菊酯農(nóng)藥的檢出限在0.0040 mg/kg～0.0108 mg/kg之間，25種農(nóng)藥分離的色譜圖見圖5。

圖4 不同PSA用量對(duì)25種農(nóng)藥回收率的影響1.α-BHC、2.γ-BHC、3.β-BHC、4. 七氯、5.δ-BHC、6. 艾氏劑、7.o,p’-DDE、8.α-硫丹、9.p,p’-DDE、10.o,p’-DDD、11.o,p’-DDT、12.p,p’-DDD、13.β- 硫丹、14. p,p’-DDT、15. 聯(lián)苯菊酯、16. 硫丹硫酸酯、17. 甲氰菊酯、18.高效氯氟氰菊酯、19. 三氯殺螨砜、20. 氯菊酯、21. 噠螨靈、22. 氯氰菊酯、23. 氟氰戊菊酯、24. 高效氰戊菊酯、25. 溴氰菊酯

圖5 25種有機(jī)氯和擬除蟲菊酯農(nóng)藥的GC-ECD色譜圖1.α-BHC、2.γ-BHC、3.β-BHC、4. 七氯、5.δ-BHC、6. 艾氏劑、7.o,p’-DDE、8.α-硫丹、9.p,p’-DDE、10.o,p’-DDD、11.o,p’-DDT、12.p,p’-DDD、13.β- 硫丹、14. p,p’-DDT、15. 聯(lián)苯菊酯、16. 硫丹硫酸酯、17. 甲氰菊酯、18.高效氯氟氰菊酯、19. 三氯殺螨砜、20. 氯菊酯、21. 噠螨靈、22. 氯氰菊酯、23. 氟氰戊菊酯、24. 高效氰戊菊酯、25. 溴氰菊酯

2.6 方法的回收率和精密度

在空白茶葉基質(zhì)中分別加入適量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，使各農(nóng)藥的加標(biāo)濃度為10倍定量限(S/N=10)，實(shí)驗(yàn)平行操作5次，計(jì)算方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表1。

表1 25種有機(jī)氯與擬除蟲菊酯農(nóng)藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.7 方法的應(yīng)用

針對(duì)企業(yè)開發(fā)的前處理方法分析一個(gè)茶葉樣品，需要有機(jī)溶劑10 mL，處理時(shí)間約40 min，分散固相填料成本低于5元，適用于茶葉企業(yè)監(jiān)測(cè)茶葉中的農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)。應(yīng)用本方法對(duì)2個(gè)綠茶樣品和2個(gè)花茶樣品進(jìn)行上述25種有機(jī)氯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的篩查檢測(cè)，結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)顯示4個(gè)茶葉樣品全部被檢出農(nóng)藥殘留，但殘留量均低于GB 2763-2012中對(duì)茶葉農(nóng)藥最大殘留限量的規(guī)定。

3 結(jié)論

采用超聲提取、分散固相萃取凈化-氣相色譜建立了茶葉中25種有機(jī)氯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的分析方法。方法的檢出限(S/N=3)是0.0040～0.1084 mg/kg；在10倍定量限(S/N=10)的添加水平，大部分農(nóng)藥的平均回收率在70.00～105.00%之間；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=5)是5.07%～11.29%。同普通SPE方法相比，所建方法快速簡(jiǎn)便、成本低廉，具有在企業(yè)推廣應(yīng)用的實(shí)際意義。

表2 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果 (mg/kg)

(ND: 未檢出)

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