慢性阻塞性肺疾病各期抗M2受體抗體mRNA表達水平及機理分析

張 偉，姚玉強，谷明明，孫璐璐，韓 佳

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟南 250011；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250014)

慢性阻塞性肺疾病各期抗M2受體抗體mRNA表達水平及機理分析

張 偉1，姚玉強2*，谷明明2，孫璐璐2，韓 佳2

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟南 250011；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250014)

目的：通過觀察慢性阻塞性肺疾病(COPD)不同時期大鼠模型組的抗M2受體抗體mRNA表達水平、心肌細胞的病變程度，來分析COPD在不同分期對心臟的影響。方法:健康雄性Wistar大鼠32只，隨機分為4組(正常組A、COPD組B、COPD急性加重組C、COPD并發(fā)肺心病組D)。通過氣管內(nèi)滴入脂多糖和被動吸煙的方法建立COPD大鼠模型，COPD模型大鼠再次氣管滴入LPS造成急性加重,在COPD的基礎(chǔ)上尾靜脈注射三氯化鐵建立COPD并發(fā)肺心病模型。RT-PCR法檢測血中抗M2受體抗體mRNA含量，電鏡觀察心臟結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果:抗M2受體抗體mRNA在B、C組表達均升高(P<0.05)，在D組表達最高，較AB組均有明顯增高(P<0.01)，電鏡下心組織損傷程度依次明顯,抗M2受體抗體mRNA的表達水平與在電鏡下觀察的心肌細胞損傷程度有相關(guān)性。結(jié)論：M2受體抗體在大鼠COPD并發(fā)肺心病模型組中最高，表明COPD病程后期繼發(fā)肺心病與對M2受體的自身免疫密切相關(guān)。大鼠心肌細胞病理改變程度與M2受體抗體mRNA表達水平相關(guān)，提示抗M2受體抗體對COPD病程中心臟病變的發(fā)生與發(fā)展具有重要作用。

慢性阻塞性肺疾病;抗M2受體抗體mRNA;大鼠

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以不完全可逆性氣流受限及氣道持續(xù)性炎癥為特征的疾病，呈進行性發(fā)展，臨床上以進行性呼出氣流減少、呼氣末容量增大、低氧血癥、高碳酸血癥和進行性肺動脈高壓為特征。屬于中醫(yī)學(xué)“肺脹”“喘證”“咳嗽”“痰飲”等范疇，臨床表現(xiàn)為咳、痰、喘、胸部脹悶等。肺心病是COPD的常見轉(zhuǎn)歸，在COPD的病理生理過程中，由于炎性因子或介質(zhì)、血管內(nèi)皮、血小板、黏附因子的作用，導(dǎo)致COPD患者肺動脈高壓，引起心功能損害，結(jié)構(gòu)改變，引起右心衰竭。近幾年的研究表明，在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病過程中，心臟主要受體的功能有明顯的變化，并發(fā)現(xiàn)循環(huán)血中免疫復(fù)合物增加與心功能異常有相關(guān)性。[1]這些提示在COPD的發(fā)病過程中，可能也有心臟受體抗體的免疫學(xué)機制參與，最終導(dǎo)致肺心病的形成。本研究在實驗室中模擬制作COPD不同時期的大鼠模型，通過檢測各模型組的抗M2受體抗體mRNA的表達水平，并觀察心、肺組織病理改變，揭示COPD發(fā)病過程中與心肌損害程度的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠(山東大學(xué)提供，許可證號SCXK魯20090001)32只，體質(zhì)量(200±20)g。飼料為標(biāo)準(zhǔn)塊料(山東中醫(yī)藥大學(xué)提供)，飼養(yǎng)在20～25 ℃，濕度40%的動物房內(nèi)，自由攝食飲水。

1.2 試劑儀器 脂多糖(LPS)(美國Sigma公司)三氯化鐵FeCl3(濟南星聯(lián)星科技有限公司)，RT-PCR試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，煙熏箱(100cm×80cm×50cm)及煙熏裝置(自制)，指定品牌香煙，水合氯醛(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，批號：20120209)，勻漿機(IKAwoks，型號：T25basic)，電子天平(梅特勒-托利多(常州)稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司,型號：APA6000F)，光鏡病例圖像分析(OLYMPCIS，型號CX-32rfl)，PCR擴增儀(ABI公司,型號：7300，軟件：7300SystemSDSsoftware)，冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠，型號:TGL-16B)，70 ℃水浴箱(杭州奧盛，型號：K10CD)，電子顯微鏡(日本電子，型號JEM-1200EX)，圖像處理系統(tǒng)(美國GATAN)。

1.3 方法

1.3.1 模型建立 用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為4組：正常組(A)、COPD組(B)、COPD急性加重組(C)，COPD合并肺心病組(D)，每組8只，雄性。適應(yīng)性喂養(yǎng)3d。第1,14天大鼠麻醉后氣管內(nèi)滴LPS0.2mL(200μg)，第2～28天給予大鼠每天2次香煙煙熏,每次煙熏香煙12支，持續(xù)時間大約1h，間隔4h(滴脂多糖當(dāng)天不煙熏)。被動吸煙方法：將大鼠放入自制的有機玻璃染毒箱(100cm×80cm×50cm)內(nèi)，將香煙放入自制煙熏裝置中，點燃后，用打氣筒將香煙煙霧注入染毒箱內(nèi)(此操作頻率為1支煙/5min)，進行大鼠被動吸煙染毒。為減少香煙燃燒所產(chǎn)生的水蒸氣對大鼠的影響，采用冷凝管降低香煙溫度、濕度，并在箱底放置適量硅膠干燥劑。第28天氣管再次滴LPS制作COPD急性加重模型。從第16天每3天經(jīng)尾靜脈緩慢注射0.6%FeCl3(0.2mL/100g大鼠)制作COPD合并肺心病模型。

1.4 動物處理及指標(biāo)檢測

1.4.1 一般情況觀察 包括大鼠的活動度、對外界反應(yīng)的靈敏度、皮毛光澤、口唇鼻毛色澤、體質(zhì)量、飲食、呼吸等情況。

1.4.2 取材及指標(biāo)檢測 大鼠用水合氯醛按0.3mL/100g腹腔注射麻醉，用經(jīng)肝素鈉沖管的5mL注射器經(jīng)腹主動脈抽取5mL新鮮血液后，放血處死。迅速剪開胸腔取出心肺組織，用冰水沖洗血跡，用濾紙吸去水分，一部分放入裝有福爾馬林的病理瓶，經(jīng)10%中性福爾馬林48h充分固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)4μm切片2張，分別進行常規(guī)HE染色。另一部分放入石蠟盤中，垂直心肌纖維方向，切成1mm×1mm×2mm大小，放入-70 ℃，備電鏡觀察。血液經(jīng)1 200r/min低溫4 ℃離心15min后取血漿，-70 ℃保存，RT-PCR法檢測抗M2受體抗體mRNA的表達。方法如下：2 500r離心20min，取血漿上清液1mL，采用LiquidSampleRNAReagent、氯仿/異丙醇法提取組織中RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10min，95 ℃變性15s，60 ℃退火1min，40個循環(huán)?？筂2受體抗體mRNA堿基序列：上游：5＇-CgCTCCTTgATgCTACTg-3＇，下游：5＇-TTgCTgCCCTTgTTgTAC-3＇。

2 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況觀察 正常組大鼠活動度可，對外界反應(yīng)靈敏，皮毛光亮，口唇鼻無紫紺，體質(zhì)量較其他組大鼠重，飲食呼吸可。COPD組大鼠活動度尚可，對外界反應(yīng)靈敏，皮毛黃暗，無光澤，可聞及呼吸音、哮鳴音，活動無明顯受限。COPD急性加重期大鼠活動受限，對外界反應(yīng)靈敏，皮毛黃暗，無光澤，可聞及呼吸音、哮鳴音，口唇紫紺，本組死亡率最高。COPD合并肺心病組大鼠活動受限，活動后心跳明顯加快，呼吸急促，口唇紫紺，哮鳴音明顯。

3.2 血抗M2受體抗體mRNA表達 見圖1。

注：△▲與正常組對照，□■與CODP組對照：△□P<0.05，▲■P<0.01。圖1 各組大鼠血漿抗M受體抗體mRNA含量

抗M2受體抗體mRNA在B組，C組，D組的表達依次增高C,D組較A組有明顯增高(P<0.01)。D組表達最高，較AB均有明顯增高(P<0.01)。

3.3 電鏡下心臟超微結(jié)構(gòu) 見圖2。

正常對照組A：心肌細胞正常，線粒體豐富。COPD組B：心肌內(nèi)血管上皮部分損傷。COPD急性加重組C：核膜受損，線粒體腫脹，纖維排列不規(guī)則。COPD并發(fā)肺心病組D：核膜不完整，線粒體腫脹，纖維排列不規(guī)則，模糊。

4 討論

目前發(fā)現(xiàn)多種心臟病患者血清中存在抗心臟M2膽堿能受體的自身抗體。Magnusson等[2]在研究原發(fā)性擴張性心肌病中發(fā)現(xiàn)患者血清中存在抗心臟β1腎上腺素能受體的自身抗體，之后又有研究發(fā)現(xiàn)， 在該病患者血清中存在抗心臟M2膽堿能受體的自身抗體。國外研究小組的研究還證明[3]，利用β1或M2受體表位肽段長期免疫動物，可造成心臟發(fā)生類似IDCM的形態(tài)學(xué)改變，類似肺心病的病理改變。這些提示在肺心病出現(xiàn)右心衰竭的發(fā)病過程中，可能也有心臟受體抗體的免疫學(xué)機制參與，心肌內(nèi)多種抗體:心肌線粒體ADP/ATP載體抗體、抗肌球蛋白抗體、抗β1受體抗體、抗心臟M2膽堿能受體抗體，尤其可能是M2受體自身抗體的參與。另一方面，近年來的研究表明，在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病過程中，心臟主要受體的功能有明顯的變化，并發(fā)現(xiàn)循環(huán)血中免疫復(fù)合物增加與心功能異常有相關(guān)性。本實驗發(fā)現(xiàn)在COPD模型組也出現(xiàn)抗M2受體抗體的表達增高，并且濃度與心肌損害程度有一定相關(guān)性，同時與光鏡電鏡下觀察到COPD不同時期的心肌損害程度有一定相關(guān)性，提示在COPD疾病狀態(tài)下已經(jīng)開始出現(xiàn)心臟病變，心肌損害因素已經(jīng)產(chǎn)生，這對于COPD時期預(yù)防肺心病形成具有重要意義。同時本實驗也表明，COPD時期已經(jīng)出現(xiàn)自身免疫系統(tǒng)的紊亂，也可能伴隨有除抗M2受體抗體外的多種自身抗體的產(chǎn)生異常，從一定程度上闡述COPD的發(fā)病伴隨有自身免疫功能的異常，可能為COPD的發(fā)病因素提供新的方向以及為COPD的治療和肺心病的預(yù)防提供新的途徑。

圖2 電鏡下心臟組織超微結(jié)構(gòu)

中醫(yī)學(xué)認為，COPD主要病機乃“虛、痰、瘀”，病理變化為本虛標(biāo)實、虛實夾雜的證候，氣虛血瘀的病理變化貫穿整個病程。急性加重期以實為主，穩(wěn)定期以虛為主，病位在肺，與心、肝、脾、腎諸臟密切相關(guān)[4]。本病多屬漸積而成，秉承纏綿，經(jīng)常反復(fù)發(fā)作，難期根治。若患者久病體衰，導(dǎo)致心氣不足，心脈上通與肺，氣血鼓動無力，就會出現(xiàn)血脈瘀滯。反過來瘀血會導(dǎo)致氣機升降失常，進一步加重病情[5]。同時肺脹是以肺氣脹滿不能收斂為主要特征，氣機升降是其重要病機[6]。心肺在生理上密切相關(guān)，功能上相互作用，病理上相互影響。心肺兩臟調(diào)節(jié)氣血運行的作用密切相關(guān)，氣血運行失常是肺脹發(fā)生的重要原因。

肺心病起病首先以肺為重，即首先出現(xiàn)的癥狀和特點以肺系為主，最終形成肺心病并累及至心系。中醫(yī)認為：COPD屬于肺心同病，以肺、心為中心兼及五臟。雖然肺心病的最終發(fā)展結(jié)果一定是五臟功能失調(diào)，但是五臟受損的輕重程度不同，不同臟腑在肺心病的發(fā)病中所起的作用不同，心肺是主要病位，是發(fā)病核心。本實驗進一步認證了五臟一體觀的科學(xué)性。把“見肺之病，知肺傳心，當(dāng)先調(diào)心”作為治療COPD，預(yù)防肺心病發(fā)生的重要指導(dǎo)思想。

[1]Gershwin,M.E.riskfactorsandcomorbiditiesinprimarybiliarycirrhosis:Acontrolledinterview-basedstudyof1032patients[J].Hepatology,2005,42(5):1194-1202.

[2]宋一平，崔德健，茅培英.慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立及藥物干預(yù)的影響[J].軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報，2001，22(2)：99-102.

[3]JohnWA,JoanHB.G-proteiningrowthandapoptosis:lessonsfromtheheart[J].Oncogene,2011(20):1626-1634.

[4]林琳,吳蕾,許銀姬.慢性阻塞性肺疾病五臟相關(guān)理論之病機傳變模式探討[J].江蘇中醫(yī)藥，2008，40(8)：67-69.

[5]考希良，張偉.從瘀探討肺纖維化的中醫(yī)病因病機[J].吉林中醫(yī)藥,2012(10)：1250-1251.

[6]張偉，孫璐璐.肺間質(zhì)與筋的關(guān)系及慢性阻塞性肺疾病治療新思路[J].吉林中醫(yī)藥,2012(6)：550-551.

R541.5

A

1003-5699(2013)06-0609-03

“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專項經(jīng)費資助(ts20110819)及山東省自然科學(xué)基金項目(Y2006C114)。

張 偉(1963-)，男，主任醫(yī)師,教授，博士，博士研究生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)肺病學(xué)。

*[通信作者] 姚玉強，Tel:18766400195，E-mail：254586177@qq.com。

2012-11-26)