增生性瘢痕不同時(shí)期成纖維細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的初步研究

龍 艷，王達(dá)利，魏在榮，郭常敏

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 燒傷整形外科，貴州 遵義 563099)

增生性瘢痕不同時(shí)期成纖維細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的初步研究

龍 艷，王達(dá)利，魏在榮，郭常敏

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 燒傷整形外科，貴州 遵義 563099)

目的體外分離培養(yǎng)人肉芽組織、1年及2年增生性瘢痕不同時(shí)期的成纖維細(xì)胞，探討其成骨、成脂、成軟骨分化潛能，為創(chuàng)面修復(fù)治療提供新的供體細(xì)胞來(lái)源。方法采用機(jī)械法結(jié)合酶消化法分離培養(yǎng)肉芽組織、1年及2年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及增殖情況，并繪制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Vimentin和CK19的表達(dá)。通過(guò)向成骨、成脂、成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化鑒定多向分化潛能。結(jié)果成纖維細(xì)胞主要以長(zhǎng)梭形為主，呈放射狀、旋渦狀生長(zhǎng)；肉芽組織成纖維細(xì)胞增殖活力最強(qiáng)。三種來(lái)源的成纖維細(xì)胞均表達(dá)Vimentin，不表達(dá)CK19，經(jīng)誘導(dǎo)可向骨、脂肪、軟骨細(xì)胞方向分化。結(jié)論人肉芽組織到增生性瘢痕不同時(shí)期的成纖維細(xì)胞具有多向分化潛能，可作為創(chuàng)面修復(fù)治療及組織工程研究的理想供體細(xì)胞。

增生性瘢痕；肉芽組織；成纖維細(xì)胞；誘導(dǎo)分化

增生性瘢痕是皮膚創(chuàng)傷后過(guò)度愈合的一種必然的不良結(jié)果，可引起受累部位外形損毀和不同程度的功能障礙，一直是整形外科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。成纖維細(xì)胞(fibroblasts，F(xiàn)B)是創(chuàng)傷愈合的主要修復(fù)細(xì)胞[1]，參與了創(chuàng)傷愈合的全過(guò)程，其生物學(xué)行為直接決定著創(chuàng)面愈合的質(zhì)量與結(jié)果[2]。Lekic 等[3]將成纖維細(xì)胞比作損傷組織修復(fù)的工程師、建筑者和管理員。近來(lái)有研究表明成纖維細(xì)胞可能是間充質(zhì)干細(xì)胞的“新外衣”，表現(xiàn)出間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性[4]。也有研究表明真皮來(lái)源的成纖維細(xì)胞可以向骨、脂肪、軟骨等多種組織細(xì)胞分化[5]。本實(shí)驗(yàn)選取從肉芽組織到增生性瘢痕不同時(shí)期的成纖維細(xì)胞作為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行免疫學(xué)鑒定及成骨、成脂、成軟骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化，探討不同來(lái)源成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)分化潛力及其作為創(chuàng)面修復(fù)和組織工程供體細(xì)胞的可能性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及制備 所有實(shí)驗(yàn)樣品取自遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形外科住院患者，并經(jīng)患者及家屬知情同意。人創(chuàng)面肉芽組織標(biāo)本取自深度燒傷患者第14天的創(chuàng)面，年齡25歲，創(chuàng)面局部無(wú)感染，無(wú)全身其它器質(zhì)性病變。1年及2年增生性瘢痕患者，年齡20～30歲，均為初次就診，未接受過(guò)任何治療，無(wú)全身其它器質(zhì)性疾病，以手術(shù)治療瘢痕病變，切取廢棄瘢痕組織置于L-DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100 U/mL，鏈霉素100μg/mL)，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)室進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 L-DMEM培養(yǎng)基(低糖)、胎牛血清、胰蛋白酶(含EDTA)、Ⅰ型膠原酶、中性蛋白酶、L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；bFGF購(gòu)于美國(guó)Peprotech公司；免疫細(xì)胞化學(xué)小鼠抗人CK19單克隆抗體、小鼠抗人Vimentin單克隆抗體、二步法抗兔(鼠)通用型免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于基因科技(上海)有限公司，人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基購(gòu)于中國(guó)Cyagen公司。

1.3 不同來(lái)源成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

1.3.1 肉芽組織成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng) 嚴(yán)格無(wú)菌條件下用含100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的D-PBS充分洗滌樣品3～5次,手術(shù)剪剔除淺層污染的肉芽組織，D-PBS洗滌3次，盡量剔除血管成分，將樣品剪成2 mm×2 mm×2 mm大小的組織塊，D-PBS充分洗滌3次，再剪碎至糊狀，并轉(zhuǎn)移至含0.1%Ⅰ型膠原酶(1：2)離心管中，于37℃水浴恒溫?fù)u床振蕩消化約2 h，用等體積含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)液終止消化，經(jīng)200目孔徑濾網(wǎng)過(guò)濾收集濾液，1 500 rpm離心10 min，棄上清，按1×105/mL細(xì)胞密度用含10%FBS、1%谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后首次換液，以后每2～3 d換液一次。待原代細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，采用0.125%胰蛋白酶-0.02% EDTA進(jìn)行消化，細(xì)胞按1：2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)(傳代用培養(yǎng)基系在原代培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加5 ng/mL bFGF)。

1.3.2 1年和2年增生性瘢痕組織成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng) 將瘢痕組織用含雙抗的D-PBS清洗3～5次，除皮下組織，剪切成5 mm×5 mm左右的組織塊，移入無(wú)菌玻璃瓶，用0.4%的中性蛋白酶于37℃消化25～30 min，剪去表皮，將真皮組織剪成糊狀后用0.4%Ⅰ型膠原酶、37 ℃水浴搖床中消化3 h，用等體積的含F(xiàn)BS的L-DMEM培養(yǎng)液終止消化，過(guò)濾，離心后同上法按1×105/mL細(xì)胞密度接種培養(yǎng)細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察及生長(zhǎng)曲線繪制 原代培養(yǎng)24 h后倒置顯微鏡下首次觀察細(xì)胞形態(tài)，以后每天觀察，并拍照記錄生長(zhǎng)情況。取第3代細(xì)胞，消化、離心后，以2×104/mL的密度接種于24孔板，每孔1 mL。每天各取3孔消化倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)，取平均值，連續(xù)培養(yǎng)8 d。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，分別繪制肉芽組織、1年及2年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Vimentin和CK19的表達(dá) 將第3代細(xì)胞用0.125%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，按2×104/cm2在無(wú)菌小培養(yǎng)皿中爬片，至細(xì)胞融合50%～80%時(shí)取出細(xì)胞爬片，以小鼠抗人Vimentin和CK19單克隆抗體作為一抗，二抗(IgG)為兔鼠通用型，采用ABC法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用D-PBS代替一抗作為陰性對(duì)照分析。

1.6 成纖維細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化 收集第3代細(xì)胞，參照誘導(dǎo)培養(yǎng)基說(shuō)明書要求，制備細(xì)胞懸液并按規(guī)定濃度接種于6孔板，進(jìn)行如下分化鑒定，加入常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞做陰性對(duì)照。

1.6.1 向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化 細(xì)胞接種后常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d，棄原培養(yǎng)基，每孔加入2 mL成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每隔3 d換液1次。誘導(dǎo)21 d后棄培養(yǎng)基，PBS清洗，4%中性甲醛固定，1%茜素紅進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)染色5 min，終止染色、鏡檢、拍照。

1.6.2 向成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化 細(xì)胞消化后1 000 rpm離心5 min，細(xì)胞團(tuán)塊約2 mm，不可搖動(dòng)或吹打細(xì)胞團(tuán)，加入成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。3 d換液一次，每次1 mL，換液時(shí)輕彈離心管壁使細(xì)胞團(tuán)塊脫壁懸浮。誘導(dǎo)3周后棄培養(yǎng)基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，脫蠟，蒸餾水沖洗。阿利辛藍(lán)染色液浸染30 min，終止染色、鏡檢、拍照。

1.6.3 向成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化 細(xì)胞接種后每隔3 d換液至細(xì)胞完全融合后棄原培養(yǎng)基，每孔加入2 mL成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基A，誘導(dǎo)3 d后更換為2 mL成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基B，24 h后再換回成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基A液。上述如此循環(huán)5次，再次用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基B液誘導(dǎo)7 d，每隔3 d換液一次。棄原培養(yǎng)基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，油紅O染色30 min，終止染色、鏡檢、拍照。

2 結(jié)果

2.1 成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 人創(chuàng)面肉芽組織來(lái)源的成纖維細(xì)胞接種8 h后開(kāi)始貼壁，24 h完全貼壁后細(xì)胞逐漸伸展，細(xì)胞呈短梭形、多角形或不規(guī)則形。2～3 d后細(xì)胞數(shù)量迅速增加呈匯合狀態(tài)。傳代細(xì)胞開(kāi)始貼壁時(shí)間約為2 h，細(xì)胞逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，胞質(zhì)向外伸出偽足。細(xì)胞核呈卵圓形，居中，偶見(jiàn)雙核。傳代后細(xì)胞形態(tài)較為均一，排列規(guī)則，呈平行狀、放射狀、旋渦狀生長(zhǎng)(見(jiàn)圖1A)。1年和2年人增生性瘢痕來(lái)源的成纖維細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)的長(zhǎng)梭型細(xì)胞，原代細(xì)胞呈多角形集落樣生長(zhǎng)，體積較小。2～3 d后細(xì)胞數(shù)迅速增加。細(xì)胞密度低時(shí)細(xì)胞之間排列疏松，有較大細(xì)胞間隙；細(xì)胞密度高時(shí)細(xì)胞相互平行排列，或呈放射狀、編織狀或漩渦狀集落樣生長(zhǎng)。胞體狹長(zhǎng)、透亮，胞漿豐富，胞核清晰；1年和2年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞大小和形態(tài)無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖1B、C)。

注：A:肉芽組織成纖維細(xì)胞 B:1年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞 C:2年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞。 圖1 肉芽組織、1年及2年增生性瘢痕第3代成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×100)

2.2 成纖維細(xì)胞增殖活力 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示，第1～2天細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，第3～5天呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，增殖活躍，第6天到頂峰，第7～8天生長(zhǎng)速度減慢進(jìn)入平臺(tái)期。

肉芽組織成纖維細(xì)胞增殖活力最強(qiáng)，1年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞次之，2年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖活力較弱。

組別培養(yǎng)天數(shù)第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天肉芽2±02.6±0.23.3±0.24.4±0.25.8±0.16.3±0.36.2±0.11年2±02.3±0.32.6±0.1**3.8±0.1**4.8±0.3**5.5±0.3*5.5±0.52年2±02.2±0.82.4±0.1**3.2±0.3**△3.9±0.1**△△5.3±0.3*5.3±0.4*

注：與肉芽比較，*P<0.05,**P<0.01；與1年增生性瘢痕比較，△P<0.05,△△P<0.01。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)波形蛋白和角蛋白19 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示：肉芽組織、1年和2年增生性瘢痕來(lái)源的成纖維細(xì)胞均為Vimentin陽(yáng)性表達(dá)，不表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK19(見(jiàn)圖 3)。

2.4 體外誘導(dǎo)分化檢測(cè)

2.4.1 向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化 成骨誘導(dǎo)約7 d細(xì)胞外基質(zhì)見(jiàn)少量鈣鹽沉積，形成少量鈣結(jié)節(jié)，隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，鈣鹽沉積增加，成骨誘導(dǎo)21 d細(xì)胞結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞逐漸融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，形成明顯的骨化結(jié)節(jié)。進(jìn)行茜素紅染色呈陽(yáng)性表達(dá)，鏡下見(jiàn)大量大小不一的紅色鈣鹽沉積，鈣結(jié)節(jié)被染成暗紅色(見(jiàn)圖4)。

圖2 肉芽組織、1年及2年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

注：A: 成纖維細(xì)胞Vimentin陽(yáng)性表達(dá)；B: 成纖維細(xì)胞CK19陰性表達(dá)。 圖3 成纖維細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)Vimentin、CK19的表達(dá)情況(×200)

注：A:肉芽組織成纖維細(xì)胞細(xì)胞成骨誘導(dǎo)21 d茜素紅染色陽(yáng)性；B:1年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞成骨誘導(dǎo)21 d茜素紅染色陽(yáng)性；C:2年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞成骨誘導(dǎo)21 d茜素紅染色陽(yáng)性。 圖4 肉芽組織、1年及2年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞成骨誘導(dǎo)21 d茜素紅S染色結(jié)果(×200)

2.4.2 向成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化 成脂肪誘導(dǎo)8 d后，形態(tài)逐漸由長(zhǎng)梭形變?yōu)槎嘟切魏蜋E圓形，細(xì)胞體積逐漸增大，有小脂滴出現(xiàn)。隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，小脂滴逐漸增多增大并逐漸聚集，27 d后多數(shù)細(xì)胞被誘導(dǎo)成為成熟的脂肪細(xì)胞，油紅O染色呈陽(yáng)性，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)橘紅色顆粒，此顆粒為脂滴(見(jiàn)圖5)。

注：A:肉芽組織成纖維細(xì)胞細(xì)胞成脂肪誘導(dǎo)27 d油紅O染色陽(yáng)性;B:1年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞成脂肪誘導(dǎo)27 d油紅O染色陽(yáng)性;C:2年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞成脂肪誘導(dǎo)27 d油紅O染色陽(yáng)性。 圖5 肉芽組織、1年及2年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞成脂肪誘導(dǎo)27 d油紅O染色結(jié)果(×200)

2.4.3 向成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化 軟骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)逐漸由梭型轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切?、不?guī)則形，誘導(dǎo)21 d后形成軟骨細(xì)胞，阿利辛藍(lán)染色呈陽(yáng)性(見(jiàn)圖6)。

注：A:肉芽組織成纖維細(xì)胞細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)21 d阿利辛藍(lán)染色陽(yáng)性；B:1年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)21 d阿利辛藍(lán)染色陽(yáng)性；C:2年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)21 d阿利辛藍(lán)染色陽(yáng)性。 圖6 肉芽組織、1年及2年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)21天阿利辛藍(lán)染色結(jié)果(×200)

3 討論

增生性瘢痕一直是整形外科領(lǐng)域比較棘手的難題，至今為止，其形成機(jī)制仍不十分清楚，防治也一直是有待攻克的大難題。鑒于成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖在其發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，從組織工程角度入手解決這個(gè)世界難題，是科學(xué)家一直關(guān)注的焦點(diǎn)。構(gòu)建組織工程首先需要大量高密度的種子細(xì)胞，應(yīng)具備來(lái)源廣泛、取材方便和對(duì)機(jī)體創(chuàng)傷小、體外增殖能力強(qiáng)及不易老化等特點(diǎn)。成纖維細(xì)胞是結(jié)締組織中最常見(jiàn)的細(xì)胞，由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來(lái)，在人體內(nèi)分布范圍最廣，同時(shí)也是參與組織修復(fù)全過(guò)程最重要的一類細(xì)胞，體外增殖與合成能力旺盛，多次傳代仍保持較強(qiáng)的增殖能力，取材與培養(yǎng)均十分簡(jiǎn)便，可視為人體內(nèi)數(shù)量最大的“種子細(xì)胞庫(kù)”[6]。近年來(lái)，成纖維細(xì)胞在創(chuàng)傷修復(fù)及組織再生方面研究較多且進(jìn)展較快，深入探討肉芽組織、1年和2年增生性瘢痕來(lái)源的成纖維細(xì)胞的多向分化潛能，可以深入了解創(chuàng)面愈合發(fā)生發(fā)展過(guò)程中成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性。由于增生性瘢痕本身被視為廢棄組織，因其可在體外大規(guī)模擴(kuò)增及生物學(xué)特性穩(wěn)定等特性，那么增生性瘢痕來(lái)源的成纖維細(xì)胞是否可以變廢為寶，是否有希望作為組織工程種子細(xì)胞呢?

本研究中分離、培養(yǎng)出的肉芽組織，1年和2年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞均為貼壁生長(zhǎng)的長(zhǎng)梭行細(xì)胞。Vimentin是來(lái)源于間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞骨架成分，被認(rèn)為是最常見(jiàn)的間充質(zhì)干細(xì)胞表型標(biāo)志物[7]，而細(xì)胞角蛋白CK19是上皮細(xì)胞的特征性標(biāo)記物，本實(shí)驗(yàn)Vimentin陽(yáng)性表達(dá)、CK19陰性表達(dá)，即排除了在原代培養(yǎng)時(shí)混雜入表皮干細(xì)胞干擾試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)情況證明分離培養(yǎng)的細(xì)胞是來(lái)源于間充質(zhì)細(xì)胞且為高純度的成纖維細(xì)胞。肉芽組織成纖維細(xì)胞、1年和2年增生性瘢痕成纖維細(xì)胞成骨誘導(dǎo)21 d茜素紅染色陽(yáng)性、成脂肪誘導(dǎo)27 d油紅O染色陽(yáng)性及成軟骨誘導(dǎo)21 d后阿利新藍(lán)染色陽(yáng)性。說(shuō)明肉芽組織、1年和2年增生性瘢痕來(lái)源的成纖維細(xì)胞在特定條件下均能向成骨、成軟骨及成脂肪細(xì)胞多向分化，且該誘導(dǎo)培養(yǎng)體系穩(wěn)定、可靠，為創(chuàng)面修復(fù)治療及組織工程學(xué)提供理想種子細(xì)胞奠定了前期研究基礎(chǔ)。

在本研究中，從肉芽組織到增生性瘢痕不同時(shí)期成纖維細(xì)胞，在特定條件下均能向成骨、成軟骨及成脂肪細(xì)胞多向分化，增生性瘢痕來(lái)源成纖維細(xì)胞具有多向分化潛能的可行性得到進(jìn)一步證實(shí)，加之來(lái)源方便，增殖能力強(qiáng)，有望為創(chuàng)面修復(fù)治療及組織工程學(xué)提供理想種子細(xì)胞。

鑒于成纖維細(xì)胞參與組織修復(fù)全過(guò)程，在組織重構(gòu)中發(fā)揮重要作用，成纖維細(xì)胞的多向分化潛能值得進(jìn)一步研究。如果通過(guò)人為干預(yù)把增生性瘢痕成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成正常組織所需的細(xì)胞類型，改變?cè)錾择：鄢衫w維細(xì)胞的生物學(xué)特性，構(gòu)建復(fù)層皮膚逆轉(zhuǎn)創(chuàng)面過(guò)度愈合形成增生性瘢痕這個(gè)不良結(jié)局，那么皮膚組織損傷則可以達(dá)到無(wú)瘢痕愈合，在整形外科領(lǐng)域?yàn)樵錾择：鄣闹委熖峁┬碌南Ｍ颓熬?。它能排出免疫排斥與過(guò)敏反應(yīng)的顧慮，可望成為安全、微創(chuàng)、有效、自然、持久的醫(yī)學(xué)美容方法。由于肉芽組織、1年和2年增生性瘢痕來(lái)源的成纖維細(xì)胞被誘導(dǎo)分化并進(jìn)一步增殖所需條件和局部微環(huán)境的復(fù)雜性尚存在許多問(wèn)題，如誘導(dǎo)后的細(xì)胞表型能否長(zhǎng)時(shí)間維持以及不同培養(yǎng)條件等作用因素對(duì)誘導(dǎo)結(jié)果的影響等，故瘢痕來(lái)源的成纖維細(xì)胞在組織工程臨床應(yīng)用方面有待進(jìn)一步研究。

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[收稿2012-08-10;修回2013-01-26]

(編輯：譚秀榮)

Preliminarystudyoninvitrodifferentiationcapacitiesofhumanfibroblastsderivedfromgranulationtissueandhypertrophicscarsindifferentperiods

Longyan,Wangdali,Weizairong,Guochangmin

(Department of Burn and Plastic Surgery, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo investigate the differentiation capacities of human fibroblasts derived from granulation tissue and hypertrophic scars in different periods into osteocytes, adipocytes and chondrocytes and further provide new sources of donor cells for the wound repair treatment.MethodsFibroblasts derived from granulation tissue and 1-year and 2-year hypertrophic scars were isolated and cultured by mechanical method combined with enzymatic digestion method. The cells morphology were observed under phase-contrast microscope and the cell proliferative curve was drawn. The expressions of vimentin and CK19 in isolated cells were detected by immunocytochemistry assay. Multipotential differentiation capacities of isolated cells into osteocytes, adipocytes and chondrocyte were identified.ResultsPrimary cultured fibroblasts isolated from different derivation were presented with spindle, polygonal and irregular shape. The proliferative capacity of the fibroblasts derived from granulation tissue was more potent than that from 1-year and 2-year hypertrophic scars. Immunocytochemistry results showed that vimentin were positively expressed in fibroblasts from 3 derivation , whereas CK19 were negatively expressed. Fibroblasts from different derivation were induced to differentiate into osteocytes, adipocytes and chondrocyte.ConclusionThe fibroblasts from granulation tissue and hypertrophic scars in different periods possess multipotent differentiation capacities and thus could be used as an ideal donor cells for the wound repair treatment and tissue engineering study.

hypertrophic scars;granulation tissue;fibroblast;inducing differentiation

R619.6

A

1000-2715(2013)02-0108-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NO：81060157)；貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)資金項(xiàng)目(NO：黔省專合字2010-70)。

王達(dá)利，男，醫(yī)學(xué)碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：創(chuàng)傷修復(fù)，E-mail:daliwangzy@sina.com。