去氫駱駝蓬堿誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)其對(duì)5-氟尿嘧啶和順鉑的敏感性*

李 強(qiáng)， 曹明溶△， 劉志龍， 蔣建偉

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院普通外科， 2醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，廣東 廣州 510632)

去氫駱駝蓬堿誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)其對(duì)5-氟尿嘧啶和順鉑的敏感性*

李 強(qiáng)1， 曹明溶1△， 劉志龍1， 蔣建偉2

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院普通外科，2醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，廣東 廣州 510632)

目的研究去氫駱駝蓬堿體外誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡過程中c-Jun N末端激酶(JNK)途徑的作用，并觀察其聯(lián)合化療藥物對(duì)HepG2細(xì)胞的影響。方法CCK-8法檢測(cè)聯(lián)合或不聯(lián)合使用JNK特異性抑制劑SP600125對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用；克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度藥物對(duì)細(xì)胞克隆形成的影響；Hoechst 33258染色法觀察細(xì)胞形態(tài)變化；PI單染檢測(cè)細(xì)胞亞二倍體率；Annexin V-PI雙染測(cè)定細(xì)胞早期凋亡水平；Western blotting檢測(cè)細(xì)胞聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、JNK和p-JNK蛋白表達(dá)的改變；聯(lián)合5-氟尿嘧啶(5-FU)或順鉑(DDP)觀察細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。結(jié)果去氫駱駝蓬堿隨藥物濃度的升高而抑制作用增強(qiáng)，48 h后IC50為9.80 mg/L；去氫駱駝蓬堿能顯著抑制細(xì)胞克隆形成，并且導(dǎo)致細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化；PI單染檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期的G1期前有亞二倍體凋亡峰，Annexin V-PI 雙染檢測(cè)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的早期凋亡細(xì)胞群；Western blotting檢測(cè)到隨著去氫駱駝蓬堿濃度增加PARP及p-JNK蛋白表達(dá)增加，JNK蛋白表達(dá)減少；聯(lián)合使用SP600125對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用減弱；聯(lián)合5-FU或順鉑明顯增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，增敏倍數(shù)分別為1.47和5.78倍。結(jié)論去氫駱駝蓬堿對(duì)HepG2細(xì)胞有增殖抑制作用，并誘導(dǎo)其凋亡，激活JNK信號(hào)通路可能是其主要機(jī)制之一；同時(shí)去氫駱駝蓬堿可以增強(qiáng)HepG2細(xì)胞對(duì)5-FU和順鉑的敏感性。

去氫駱駝蓬堿； HepG2細(xì)胞； c-Jun N末端激酶; 細(xì)胞凋亡

近年來研究發(fā)現(xiàn)，去氫駱駝蓬堿(harmine)可以通過人肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，并通過啟動(dòng)線粒體途徑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡[1]，發(fā)揮抗肝癌作用。本文觀察去氫駱駝蓬堿誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用，探討c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在細(xì)胞凋亡中的作用。

材 料 和 方 法

1主要材料和儀器

HepG2細(xì)胞由暨南大學(xué)生物化學(xué)教研室劉譽(yù)教授惠贈(zèng)。去氫駱駝蓬堿純度為99.8%，棕色小瓶裝，購(gòu)自西安飛達(dá)生物有限公司。DMSO、胰蛋白酶和Hoechst 33258均購(gòu)自Sigma。新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco。Annexin V-PI雙染試劑盒購(gòu)自北京寶賽生物技術(shù)公司。CCK-8購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。SP600125(JNK抑制劑)及聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]、JNK和p-JNK抗體購(gòu)自Cell Signal。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，每3 d傳代1次，細(xì)胞貼壁達(dá)到80%時(shí)，以0.25%胰酶消化傳代。

2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(5×107/L)，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h后加藥，設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、DMSO對(duì)照組(濃度為0.1%)和去氫駱駝蓬堿各組(終濃度為0.625、1.25、2.5、5、10、20 mg/L)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A570)，按下列公式求增殖抑制率，增殖抑制率(% ) = (1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組) ×100%，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3克隆形成抑制實(shí)驗(yàn) 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將細(xì)胞懸液調(diào)成300 cells/well接種于12孔培養(yǎng)板，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h后加藥，設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、DMSO對(duì)照組(濃度為0.1%)和去氫駱駝蓬堿各組(終濃度為0.625、1.25、2.5、5 mg/L)，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7 d后，吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液固定10 min后晾干，結(jié)晶紫染色15 min后流水沖洗，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆(>20個(gè)細(xì)胞記1個(gè)克隆)并拍照。

2.4Hoechst 33258染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將細(xì)胞懸液調(diào)成1.0×104/L接種于6孔培養(yǎng)板，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h后加藥，設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、DMSO對(duì)照組(濃度為0.1%)和去氫駱駝蓬堿組(5 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后消化收集細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞，取250 μL細(xì)胞懸液涂片，室溫自然干燥，用甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液固定20 min，用Hoechst 33258 染色工作液(10 mg/L)避光染色10 min，流水沖脫，熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.5PI單染和Annexin V-PI雙染實(shí)驗(yàn) 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將細(xì)胞懸液調(diào)成1.0×107/L接種于12孔培養(yǎng)板，2 mL/well，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h后加藥，設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、DMSO對(duì)照組(濃度為0.1%)和去氫駱駝蓬堿各組(終濃度為5、10和20 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后按照試劑盒步驟消化收集細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)，BD FAC Sort Cell Quest 軟件分析處理結(jié)果。

2.6Western blotting檢測(cè)蛋白變化 收集6孔板(對(duì)照組和去氫駱駝蓬堿處理組細(xì)胞)，冷PBS洗2次，在孔板內(nèi)加入細(xì)胞裂解液冰上裂解10 min，離心，吸取上清，BCA法測(cè)蛋白濃度。取適量蛋白，用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜(恒壓100 V，轉(zhuǎn)膜1.5～2 h)，印跡膜在含有5%脫脂牛奶的TBS-T緩沖液中封閉2 h，GAPDH (1∶4 000)、PARP、JNK和p-JNK(1∶1 000)Ⅰ抗孵育過夜，洗滌，Ⅱ抗(1∶3 000)孵育1 h，ECL發(fā)光液孵育后，X光片感光定影，掃描紀(jì)錄。

2.7CCK-8法檢測(cè)聯(lián)合使用SP600125細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，5×107/L接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h后加藥，設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、DMSO組(濃度為0.1%)和SP600125組(濃度為10 μmol/L)、去氫駱駝蓬堿組(終濃度2.5 mg/L)和SP600125與去氫駱駝蓬堿聯(lián)合使用組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。SP600125預(yù)處理細(xì)胞1 h后，加入藥物，培養(yǎng)48 h，CCK-8法檢測(cè)各孔的吸光度，并計(jì)算增殖抑制率。

2.8藥物敏感實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，5.0×107/L，取100 μL接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h后加藥。對(duì)不同藥物的實(shí)驗(yàn)都分為4組：細(xì)胞對(duì)照組、化療藥物組、去氫駱駝蓬堿組和化療藥物與去氫駱駝蓬堿聯(lián)合使用組。培養(yǎng)48 h，CCK-8法檢測(cè)各孔的吸光度，計(jì)算各組抑制率及IC50。去氫駱駝蓬堿終濃度為2.5 mg/L，順鉑和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)終濃度均為1.25、2.5、5和10.0 mg/L。化療增敏倍數(shù)=單用時(shí)化療藥物IC50/聯(lián)合用藥時(shí)化療藥物IC50。并采用金正均Q值法判斷化療藥物與去氫駱駝蓬堿聯(lián)合使用的效果：Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)，Ea和Eb分別為單用去氫駱駝蓬堿和單用化療藥物的抑制率，Ea+b為合并用藥的抑制率。式中分子代表“實(shí)測(cè)合并效應(yīng)”，分母是“期望合并效應(yīng)”，Q值是兩者之比，Q<0.85為拮抗作用，0.85≤Q<1.15為相加作用，Q≥1.15為協(xié)同作用。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析(One-way ANOVA)分析組間差異的顯著性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1去氫駱駝蓬堿對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用

不同濃度去氫駱駝蓬堿作用于細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比出現(xiàn)增殖抑制作用，去氫駱駝蓬堿為1.25 mg/L時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IC50為9.80 mg/L，空白組與DMSO組相比無顯著差異(P>0.05)。隨著去氫駱駝蓬堿濃度的增加，細(xì)胞的增殖抑制越明顯，表明去氫駱駝蓬堿以劑量依賴的方式抑制HepG2細(xì)胞的增殖，見圖1。不同濃度去氫駱駝蓬堿作用細(xì)胞7 d后，與對(duì)照組相比較克隆形成數(shù)量明顯減少，且克隆逐漸變小，去氫駱駝蓬堿濃度為1.25 mg/L時(shí)，即產(chǎn)生明顯的克隆形成抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到5 mg/L時(shí)，基本無克隆細(xì)胞株形成，見圖2。

2去氫駱駝蓬堿誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

Hoechst 33258染色可見，去氫駱駝蓬堿組細(xì)胞核固縮、邊聚、裂解、凋亡小體形成等凋亡形態(tài)學(xué)變化，見圖3。不同濃度去氫駱駝蓬堿作用細(xì)胞48 h后，用Annexin V-PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率，隨著去氫駱駝蓬堿濃度增加，早期凋亡率明顯增加，各組的早期凋亡率分別為：(7.12±0.21)%、(7.23±0.35)%、(20.07±0.46)%、(31.75±0.24)%和(63.91±0.67)%,見圖4A；同時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的亞二倍體凋亡峰，隨著去氫駱駝蓬堿濃度的增大，HepG2細(xì)胞的亞二倍體百分率增加，各組的亞二倍體率分別為：(5.23±0.11)%、(4.57±0.45)%、(10.67±0.36)%、(18.75±0.76)%和(21.35±0.77)%，見圖4B。

Figure 1. Effect of harmine on the proliferation of HepG2 cells determined by CCK-8 assay. 1: control; 2: DMSO; 3～8: 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 and 20 mg/L harmine, respectively. Mean±SD.n=3.#P<0.05vs1 or 2.

圖1CCK-8法檢測(cè)去氫駱駝蓬堿對(duì)細(xì)胞存活率的影響

Figure 2. Colony formation assay was used to evaluate the effects of harmine on the proliferation of HepG2 cells. HepG2 cells were treated with 0.625, 1.25, 2.5 and 5 mg/L harmine for 7 d.

圖2克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察去氫駱駝蓬堿對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用

Figure 3. Harmine-induced apoptosis of HepG2 cells assessed by Hoechst 33258 staining (×200). Morphology of HepG2 cells exposed to harmine at different concentrations was observed under fluorescence microscope.A:DMSO;B:0 mg/L harmine;C:5 mg/L harmine.

圖3Hoechst33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

Figure 4. Apoptosis of HEG2 cells detected by flow cytometry.A:Annexin V-FITC/PI staining,B:sub-G1fraction.Mean±SD.n=3.#P<0.05vsDMSO or 0 mg/L harmine.

圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

3Westernblotting檢測(cè)PARP、JNK和p-JNK蛋白的表達(dá)

Western blotting檢測(cè)去氫駱駝蓬堿作用于HepG2細(xì)胞48 h后，PARP和p-JNK蛋白隨去氫駱駝蓬堿濃度增加而增加，JNK蛋白量減少，見圖5。

4CCK-8檢測(cè)聯(lián)合SP600125對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的影響

與空白組比較，JNK單獨(dú)作用不對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生增殖抑制作用，SP600125預(yù)處理細(xì)胞1 h后，加入去氫駱駝蓬堿48 h后，細(xì)胞存活率增加，見圖6。

5藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

5.15-FU單用或與去氫駱駝蓬堿聯(lián)用HepG2的增殖抑制作用 單獨(dú)5-FU作用細(xì)胞48 h，IC50為7.12 mg/L，與2.5 mg/L去氫駱駝蓬堿聯(lián)合作用后，IC50為4.86 mg/L，增敏倍數(shù)為1.47。其中1.25 mg/L 5-FU與2.5 mg/L去氫駱駝蓬堿聯(lián)合為協(xié)同作用，Q值為1.23，見表1。

Figure 5. The effect of harmine on the protein expression evaluated by Western blotting.

圖5Westernblotting檢測(cè)HepG2細(xì)胞PARP、JNK和p-JNK蛋白的表達(dá)

Figure 6. Effects of harmine (HAM) and SP600125 on HepG2 cell viability. 1:DMSO group; 2:control group; 3: 2.5 mg/L HAM group; 4:SP600125 group; 5：2.5 mg/L HAM+SP600125 group.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsDMSO or control group.

圖6JNK特異性抑制劑對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制的影響

表15-FU聯(lián)合2.5mg/L去氫駱駝蓬堿對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

Table 1. Effects of HAM in combination with 5-FU on HepG2 cell growth inhibition(mean±SD.n=3)

5-FU5-FUcombinedwith2.5mg/LHAMQvalueConcentration(mg/L)Inhibitoryrate(%)5-FUconcentration(mg/L)Inhibitoryrate(%)00018.12±2.20—1.2510.20±2.151.2532.79±2.13#1.232.524.01±3.952.535.79±4.340.95527.89±4.27540.12±4.600.981039.97±2.781047.24±3.190.932095.67±5.12———

#P<0.05vs1.25 mg/L 5-FU alone.

5.2順鉑單用或與去氫駱駝蓬堿聯(lián)用HepG2的增殖抑制作用 單獨(dú)順鉑作用細(xì)胞48 h，IC50為14.67 mg/L，與2.5 mg/L去氫駱駝蓬堿聯(lián)合作用后，IC50為2.54 mg/L，增敏倍數(shù)為5.78。其中1.25 mg/L順鉑與2.5 mg/L去氫駱駝蓬堿聯(lián)合為協(xié)同作用，Q值為1.17，見表2。

表2順鉑聯(lián)合2.5mg/L去氫駱駝蓬堿對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

Table 2. Effects of HAM in combination with cisplatin on HepG2 cell growth inhibition(mean±SD.n=3)

CisplatinCisplatincombinedwith2.5mg/LHAMQvalueConcentration(mg/L)Inhibitoryrate(%)Cisplatinconcentration(mg/L)Inhibitoryrate(%)00018.12±2.20—1.2530.97±4.151.2550.78±3.53#1.172.546.51±5.052.554.27±6.740.97560.96±7.27567.25±5.660.991067.40±6.581070.78±4.390.962090.86±7.12———

#P<0.05vs1.25 mg/L cisplatin alone.

討 論

駱駝蓬屬(Peganum)植物為蒺藜科多年生草本植物，具有堅(jiān)固筋脈、助陽暖陰、消除黏稠體液等功能，主治筋脈軟弱、骨關(guān)節(jié)痛、神昏頭痛等癥[2-3]。駱駝蓬植物的主要化學(xué)成分為生物堿，主要包括駱駝蓬堿(harmaline)、去氫駱駝蓬堿和哈爾滿堿(harman)。去氫駱駝蓬堿是其中的主要有效成分之一，別名為哈爾明堿、肉葉云香堿，是淡黃色針狀晶體，分子量為236.7，分子式為C13H12N2O，它在駱駝蓬種子中的含量高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且具有肯定的抗腫瘤作用。從80年代早期開始，國(guó)內(nèi)就對(duì)駱駝蓬堿類化合物抗腫瘤活性及毒性展開了臨床研究，其中以去氫駱駝蓬堿的抗腫瘤作用最強(qiáng)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，去氫駱駝蓬堿對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞、胃癌MGC-803和HGC27細(xì)胞、肝癌BEL-7402細(xì)胞、鼻咽癌CNE2細(xì)胞、人胰腺癌AsPC1細(xì)胞、白血病K562細(xì)胞、小鼠結(jié)腸癌Colon26細(xì)胞等多種體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用[4-9]。在體內(nèi)抗腫瘤活性方面，去氫駱駝蓬堿對(duì)S-180小鼠、網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤L2和小鼠肝癌都有顯著療效，與順鉑、阿霉素聯(lián)用有明顯協(xié)同作用。在臨床上駱駝蓬粗提物用于治療未手術(shù)或不宜手術(shù)的惡性腫瘤，取得了較好的臨床效果[10-11]。

近來研究表明，腫瘤是細(xì)胞增殖過度和分化異常的疾病，也是凋亡異常的疾病，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞使其重新恢復(fù)凋亡，更加符合人體生理性細(xì)胞死亡過程，可以明顯減輕或消除化療藥物所導(dǎo)致的毒副作用，是一種有效的抗癌途徑。目前化療藥物種類繁多，但都不可避免產(chǎn)生很多毒副作用，比如骨髓抑制、脫發(fā)、神經(jīng)毒性等等[12-13]。許多抗癌藥物的作用機(jī)理都與它們誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)[14-15]。在本實(shí)驗(yàn)中CCK-8及克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明去氫駱駝蓬堿可有效抑制HepG2細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，其抑制細(xì)胞增殖的作用隨藥物濃度升高而增強(qiáng)，表現(xiàn)出劑量依賴性，當(dāng)藥物濃度為1.25 mg/L時(shí)，細(xì)胞克隆數(shù)明顯減少并減小。Hoechst 33258染色觀察可見明顯核固縮、邊聚、裂解、凋亡小體形成等細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。進(jìn)一步流式細(xì)胞術(shù)可見隨藥物濃度增加，早期凋亡細(xì)胞和亞二倍體細(xì)胞群明顯增加，亦呈濃度依賴性。結(jié)果表明，去氫駱駝蓬堿可抑制HepG2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

PARP是DNA修復(fù)酶，作為caspase-3的作用底物，所以PARP又被稱為死亡底物，PARP蛋白的剪切是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志。隨著藥物濃度增加，PARP蛋白表達(dá)逐漸增加。在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)去氫駱駝蓬堿活化caspase-3誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡，caspase-3作為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子，受多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控。JNK也被稱為壓力激活的蛋白激酶(stress-activated protein kinase, SAPK)，作為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族中的重要成員，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[16-17]。JNK通過其氨基酸殘基端的磷酸化而活化，一旦被激活，胞漿中的JNK轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun、活化轉(zhuǎn)錄因子2(activating transcription factor 2,ATF2)等磷酸化促進(jìn)新蛋白質(zhì)的合成或引起細(xì)胞凋亡。本研究中發(fā)現(xiàn)去氫駱駝蓬堿可以誘導(dǎo)JNK信號(hào)通路活化，使p-JNK蛋白表達(dá)隨藥物濃度增加明顯上調(diào)。應(yīng)用特異性JNK阻斷劑SP600125，預(yù)處理HepG2細(xì)胞后則能夠顯著降低該藥對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖活性。去氫駱駝蓬堿，說明去氫駱駝蓬堿可能通過線粒體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，JNK位于caspase-3的上游，但SP600125并不能完全阻斷caspase-3和PARP活化，說明去氫駱駝蓬堿可能通過其它通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，要闡明所有參與去氫駱駝蓬堿誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，尚需進(jìn)一步相關(guān)研究。

5-FU和順鉑都是目前常用的化療藥物，但毒副作用大，導(dǎo)致病人常常難以耐受。在體外實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，去氫駱駝蓬堿與5-FU和順鉑聯(lián)合作用，后者IC50較單獨(dú)使用時(shí)明顯降低，增敏倍數(shù)分別為1.47和5.78，與去氫駱駝蓬堿合用時(shí)，計(jì)算出Q值大于1.15，表明兩者合用有協(xié)同抗腫瘤作用。肝癌對(duì)化療藥物反應(yīng)不敏感，且容易產(chǎn)生耐藥性，今后可以進(jìn)一步研究協(xié)同效應(yīng)機(jī)制，并用荷肝癌動(dòng)物模型驗(yàn)證，期望臨床上聯(lián)合中藥化療可以減輕毒副作用，提高化療效果。

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HarmineinducesapoptosisofHepG2cellsviaJNKsignalingpathwayandenhancestheirchemosensitivityto5-fluorouracilandcisplatin

LI Qiang1, CAO Ming-rong1, LIU Zhi-long1, JIANG Jian-wei2

(1DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofBiochemistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tcaomr@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the proliferation-inhibitory and apoptosis-inducing effects of harmine on human hepatocarcinoma HepG2 cells.METHODSThe proliferation of HepG2 cells was determined in the absence or presence of a JNK inhibitor SP600125 by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay and colony formation test. The morphology of HepG2 cells was observed by Hoechst 33258 staining under fluorescence microscope. The cell apoptosis was analyzed by Annexin V-PI staining. The expression of apoptosis-regulated proteins,poly(ADP-ribose) polymerase (PARP),c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p-JNK, was detected by Western blotting. The sensitizing effects of harmine on HepG2 cells to chemotherapeutic drugs 5-fluorouracil (5-FU) and cisplatin were determined by CCK-8 assay.RESULTSHarmine inhibited the proliferation of HepG2 cells and induced apoptosis in a dose-dependent manner. After the JNK signaling pathway was blocked by SP600125, the cell apoptotic rate decreased significantly. Hoechst 33258 staining revealed that the nuclear fragmentation, chromosomal condensation, cell shrinkage and attachment loss appeared in the HepG2 cells treated with harmine. The percentage of the sub-G1fraction was increased and the population of early apoptotic cell death was observed. Apoptosis of HepG2 cells with harmine treatment was associated with the activation of JNK. Combined with harmine, the IC50values of 5-FU and cisplatin for the tumor cells were 1.47 and 5.78 times sensitized as compared with the correspon-ding single drug treatment groups, respectively.CONCLUSIONHarmine exhibits an anti-proliferative effect on HepG2 cells by inducing apoptosis. The JNK signaling pathway is involved in the apoptosis of HepG2 cells. Harmine enhances the chemosensitivity of the cells to 5-FU and cisplatin.

Harmine; HepG2 cells; c-Jun N-terminal kinase; Apoptosis

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.02.017

1000-4718(2013)02-0284-06

2012-10-15

2012-11-19

廣東省科技計(jì)劃(No.2010B031600248)；廣東省中醫(yī)藥管理局基金資助項(xiàng)目(No.20122114)

△通訊作者 Tel: 020-38688108； E-mail: tcaomr@jnu.edu.cn