混菌發(fā)酵廚余物產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料研究

天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)系生物技術(shù)教研室 張 怡 童應(yīng)凱 黃 亮 劉敬為 賈后壯 仝超群

廚余垃圾，俗稱泔腳，其營養(yǎng)成分含量高，所以易散發(fā)惡臭，腐爛變質(zhì)，傳播細菌和病毒。此外，其中滲雜的水分極易通過滲透作用污染地下水，廢棄油脂和殘渣則會堵塞下水道，從而嚴重污染環(huán)境（莊禧懿等，2004）。目前，我國廚余垃圾主要處置方式有兩種，一是回收直接飼喂家畜，二是混入生活垃圾進行填埋處置。但這兩種方法都會給環(huán)境帶來損害（孫向軍等，2002）。由于廚余垃圾可能含有豬瘟病菌、口蹄疫病菌、弓形蟲、旋毛蟲、沙門氏菌、彎曲桿菌等，若未經(jīng)過處理直接喂養(yǎng)畜禽，其中的細菌會通過食物鏈傳染給食用者。若將不分類收集的廚余垃圾直接進行填埋，因為其有機成分含量高，對填埋場造成的負荷會很大，會污染地表和地下水體，形成病菌滋生地 （高再興等，2003）。

若利用微生物將有機廢物轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)，不但能夠提高資源利用效率，還對改善生態(tài)環(huán)境、消除環(huán)境污染有重要意義（蘇維洲等，2003）。此外，微生物生產(chǎn)的生物飼料還具有適口性好、消化吸收率高等優(yōu)點 （于暉等，2006）。利用枯草芽孢桿菌、酵母菌等混菌對廚余垃圾進行發(fā)酵，生產(chǎn)出富含有多種酶和有益微生物的生物飼料，可達到廚余垃圾資源化利用、變廢為寶的目的（吳玉萍和董鎖成，2011）。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 廚余物 粉碎混勻后廚余物，由天津市青程畜牧養(yǎng)殖公司提供。

1.1.2 菌種 乳酸菌（Lactobacillus Beijerinck）粉末、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilus）粉末、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）粉末、啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae Hansen）粉末，由天津農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)實驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1.0 g、 氯化鈉 0.5 g、pH 7.2～7.4、121 ℃滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基：取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，水煮沸30 min，用雙層紗布濾成清液。加水至1000 mL，然后加入20 g葡萄糖完全溶解，pH自然，固體培養(yǎng)基加瓊脂20 g，121℃ 滅菌15 min。

廚余物培養(yǎng)基：取10 g研磨后的廚余物放入培養(yǎng)皿中，加入等量無菌水室溫浸泡，攪拌均勻。

其他化學(xué)試劑配制：20 g（NH4）2SO4固體溶于100 mL蒸餾水；8 g K2HPO4固體溶于100 mL蒸餾水；2 g MgSO4固體溶于100 mL蒸餾水；CaCO3固體直接添加。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基組成正交試驗設(shè)計 將配制好的試劑按照表1的因素與水平加入廚余物培養(yǎng)基中。

表 1 L9（34）正交試驗因素與水平%

1.2.2 菌懸液的制備及接種 每10 g廚余物的接菌總量要控制在0.1%左右。取兩支10 mL蒸餾水試管，滅菌冷卻待用。1號菌懸液：試管中分別加入0.03 g乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌。2號菌懸液：試管中分別加入0.05 g乳酸菌和枯草芽孢桿菌。接種時，取相應(yīng)菌懸液，每個培養(yǎng)皿中添加0.1 mL菌懸液。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量測定 含酵母菌培養(yǎng)基置于30℃培養(yǎng)2 d，其他培養(yǎng)基在37℃下培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)后，取出平板放入烘箱，在115℃下烘15 min使培養(yǎng)基和菌體內(nèi)酶失活，然后在65℃下放置12 h，粉碎過100目篩板，進行凱氏定氮，測發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 重復(fù)試驗 做兩組重復(fù)試驗，廚余物培養(yǎng)基中加入最佳比例的化學(xué)添加劑，接入對應(yīng)菌懸液0.1 mL。含酵母菌培養(yǎng)基在30℃下培養(yǎng)2 d，不含酵母菌的培養(yǎng)基在37℃下培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)后，按1.2.3中方法烘干，粉碎，測發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 1號菌懸液正交試驗結(jié)果 通過4因素3水平的正交試驗確定了酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵廚余物的最佳培養(yǎng)基組成。

從表2可知，各因素對發(fā)酵廚余物中的粗蛋白質(zhì)含量影響的大小順序是：（NH4）2SO4>CaCO3>K2HPO4>MgSO4。1號混合菌發(fā)酵廚余物的最佳培養(yǎng)基配比為：（NH4）2SO41%、K2HPO40.2%、MgSO40.01%、CaCO30%。

表2 1號菌懸液正交試驗結(jié)果分析

2.2 2號菌懸液正交試驗結(jié)果 通過4因素3水平的正交試驗確定了乳酸菌、枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵廚余物的最佳培養(yǎng)基組成。

從表3可知，4因素對發(fā)酵廚余物中的粗蛋白質(zhì)含量影響的大小順序是：（NH4）2SO4>MgSO4>CaCO3>K2HPO4。2號混合菌發(fā)酵廚余物的最佳培養(yǎng)基配比為：（NH4）2SO41.0%、K2HPO40.4%、Mg-SO40.02%、CaCO30.4%。

表3 2號菌懸液正交試驗結(jié)果分析

2.3 重復(fù)試驗 廚余物培養(yǎng)基中加入1%（NH4）2SO4、0.2%K2HPO4、0.01%MgSO4、0%CaCO3，接入1號菌懸液0.1 mL，培養(yǎng)后測得發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量為33.225%。

廚余物培養(yǎng)基中加入1%（NH4）2SO4、0.4%K2HPO4、0.02%MgSO4、0.4%CaCO3， 接入 2 號菌懸液0.1 mL，培養(yǎng)后測得發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量為32.51%。

兩重復(fù)試驗蛋白質(zhì)含量均沒有正交試驗得出的結(jié)果高，可能是由于在重復(fù)試驗過程中，實驗室試驗人員較多，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)溫度不能恒定，培養(yǎng)溫度對于混菌發(fā)酵廚余物有一定影響，所以試驗或生產(chǎn)中要保證溫度波動小。

3 討論與結(jié)論

3.1 （NH4）2SO4、K2HPO4、MgSO4的主要作用是給微生物提供必需的無機鹽，使接入的酵母菌能迅速生長，以便形成優(yōu)勢菌種。根據(jù)極差分析，（NH4）2SO4對發(fā)酵廚余物中的粗蛋白質(zhì)含量的影響最大。說明人為引入氮源可以促進菌種生長，從而促進飼料中蛋白質(zhì)含量提高。CaCO3的作用主要是調(diào)節(jié)廚余物培養(yǎng)基的pH，防止發(fā)酵過程中pH過低影響發(fā)酵。同時CaCO3起到調(diào)節(jié)口味的作用，更利于動物采食。

3.2 兩組混菌重復(fù)試驗產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量均小于正交試驗產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量，主要是由于恒溫箱溫度波動大造成的。因此在試驗或生產(chǎn)中，混菌發(fā)酵廚余物要保證溫度恒定。

3.3 從重復(fù)試驗結(jié)果可以看出，含有酵母菌的三種混菌發(fā)酵組蛋白質(zhì)產(chǎn)量為33.25%，而僅含有枯草芽孢桿菌和乳酸菌的發(fā)酵組蛋白質(zhì)產(chǎn)量為32.51%，含有酵母菌的混菌發(fā)酵組蛋白質(zhì)含量比不含酵母的發(fā)酵組的蛋白質(zhì)含量高出0.7%。說明發(fā)酵過程中添加酵母菌可以增加蛋白質(zhì)產(chǎn)量。

3.4 酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵廚余物的最佳培養(yǎng)基配比為：（NH4）2SO41%、K2HPO40.2%、MgSO40.01%、CaCO30%； 乳酸菌、枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵廚余物的最佳培養(yǎng)基配比為：（NH4）2SO41.0%、K2HPO40.4%、MgSO40.02%、CaCO30.4%。

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