雞α干擾素基因的人工合成、表達(dá)及抗病毒活性研究

山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司 程福亮 夏曉飛 聶兆晶 陳甜甜 石振飛 劉洋慶 王麗榮 谷 巍

干擾素是一種細(xì)胞因子，在抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)能力等方面有明顯效果，它分為Ⅰ型和Ⅱ型兩類，Ⅰ型主要包括IFN-α和IFN-β，Ⅱ型又稱免疫干擾素IFN-γ，主要由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生（Constanze等，2005），可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性及淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的特殊細(xì)胞毒性 （亓立峰和許梓榮，2003），從而發(fā)揮其抗病毒活性。陳紅英等（2009）用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了雞α干擾素，并證明表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞上有抗病毒活性。有文獻(xiàn)報(bào)道惠陽(yáng)胡須雞和絲羽烏骨雞IFN-α基因已成功克?。ㄍ裘鞯?，2000；夏春等，2000）。李秋霞等（2011）用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了三黃雞α干擾素，通過(guò)雞胚抗新城疫病毒試驗(yàn)證明重組干擾素具有良好的延遲和減少病毒復(fù)制的作用。在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)發(fā)表于Genebank中的三黃雞IFN-α干擾素基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，人工合成干擾素基因片段，構(gòu)建原核表達(dá)載體，進(jìn)行干擾素的原核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化和抗病毒活性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 大腸桿菌BL21和Rossta均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD-18T克隆載體為Promega公司產(chǎn)品；表達(dá)載體pET-28a由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)。

1.1.2 雞胚與病毒 SPF雞胚購(gòu)自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所；H9禽流感病毒由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司研究院分離保存。

1.1.3 試劑 T4 DNA連接酶為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶EcoR I、Not I為寶生物公司產(chǎn)品；普通DNA產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、普通DNA聚合酶、蛋白質(zhì)Marker 2000和BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒和UNIQ-10柱式DNA凝膠回收試劑盒，均為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；干擾素兔源一抗為自主制備；羊抗兔IgG-HRP為Sigma公司產(chǎn)品；IPTG、尿素、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺，均為Genview公司 （北京）產(chǎn)品；Tris堿為Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 干擾素基因的獲得及密碼子優(yōu)化 參照NCBI中已發(fā)表的雞α干擾素基因序列（AB021154），根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對(duì)去除信號(hào)肽基因序列的干擾素基因進(jìn)行密碼優(yōu)化。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)密碼子優(yōu)化后的干擾素基因，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。

引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 克隆質(zhì)粒pMD-18T-IFN-α的構(gòu)建 雞α干擾素全基因的PCR擴(kuò)增、克隆與序列測(cè)定參照《分子克隆試驗(yàn)指南》，以人工合成的干擾素基因?yàn)槟０?，采用引物IFN-α-F1和IFN-α-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min；94℃30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min， 進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，參照DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收489 bp處DNA帶，回收的PCR產(chǎn)物與PMT-18T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coil DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑選多個(gè)菌落接種含Kan的LB液體培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。

1.2.4 原核表達(dá)載體 PET-28a-IFN-α的構(gòu)建將鑒定為陽(yáng)性的干擾素基因克隆質(zhì)粒和PET-28a分別進(jìn)行EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物后連接轉(zhuǎn)化至Rossta菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑選數(shù)個(gè)單個(gè)菌種進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。

1.2.5 原核重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 將測(cè)序正確的pET-28a-IFN-α重組菌平板復(fù)壯后，挑取單菌落接種于10 mL含Kan（50 mg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4 h左右，菌液OD600達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG（1 mmol/mL）誘導(dǎo)3～4 h。離心收集菌體，超聲波破碎（360 W，30%，5 min）5 次后，分離上清液和沉淀，制備樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.6 重組雞干擾素IFN-α的純化 將大量誘導(dǎo)離心后的菌體重懸于50 mL的PBS中，超聲裂解破碎細(xì)胞，離心，棄上清液，得包涵體沉淀。用含2 mol/L Urea和4 mol/L Urea的PBS洗滌，離心，去上清液。然后將包涵體溶解于10 mL的結(jié)合緩沖液中 （0.6 mol/L NaCl，0.05 mol/L NaH2PO4，10 mmol/L咪唑，8 mol/L Urea，pH 8.0）。包涵體溶解后，高速離心15 min，取上清，按照柱層析蛋白純化試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白純化，將最終的蛋白洗脫液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 重組蛋白的體外復(fù)性及Western blotting分析 將純化后含目的條帶的洗脫液裝入透析袋中，按下列方法透析：基礎(chǔ)復(fù)性液為PBS，尿素梯度為6、4、2、0 mol/L，每個(gè)梯度透析 2 h，最后在水中透析24 h，吸出透析袋中的液體，4 ℃、12000 r/min，離心10 min，取上清用BCA法測(cè)定目的蛋白濃度，然后將目的蛋白濾過(guò)除菌，置-20℃保存。復(fù)性后的蛋白用SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的PBS封閉，以鼠抗GST抗體為一抗，羊抗鼠IgG-HRP為二抗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色，進(jìn)行干擾素蛋白Western blotting分析。

1.2.8 重組雞IFN-α抗病毒活性測(cè)定

1.2.8.1 H9禽流感病毒EID50的測(cè)定 倍比稀釋病毒，設(shè)立不同濃度的H9禽流感病毒雞胚組，通過(guò)尿囊腔接種，去除24 h內(nèi)死亡雞胚，對(duì)3 d后收集的雞胚尿囊液進(jìn)行病毒血凝價(jià)的測(cè)定，計(jì)算病毒的EID50。

1.2.8.2 重組雞IFN-α抗H9禽流感病毒活性測(cè)定 根據(jù)測(cè)定的EID50，選擇9日齡雞胚36枚，隨機(jī)分為6組，每組5只，將H9禽流感病毒稀釋至EID50，每枚注入100 μL病毒稀釋液。接病毒同時(shí)，每組分別注入不同劑量的干擾素（30、15、7.5、3.7、1.9 μg，生理鹽水為對(duì)照）。每天照蛋 1～2 次，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚。3 d后將雞胚取出，測(cè)定病毒血凝價(jià)，判定重組雞IFN-α抗H9禽流感病毒的活性效果。

2 結(jié)果

2.1 干擾素基因密碼子優(yōu)化 根據(jù)原核表達(dá)受體菌大腸桿菌Rossta對(duì)密碼子的偏好性，對(duì)Genebank中收錄的雞干擾素基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示，對(duì)原基因序列91個(gè)堿基位點(diǎn)進(jìn)行了改變，干擾素蛋白序列保持不變，大腸桿菌對(duì)其偏好性增強(qiáng)。

圖1 雞干擾素基因密碼子優(yōu)化前后對(duì)比結(jié)果

2.2 干擾素基因克隆質(zhì)粒pMD-18T-IFN-α的構(gòu)建 將合成的干擾素基因片段與克隆質(zhì)粒pMD-18T進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中的質(zhì)粒為陽(yáng)性質(zhì)粒，成功構(gòu)建了干擾素基因的克隆質(zhì)粒pMD-18T-IFN-α。

2.3 干擾素基因表達(dá)載體pET-28a-IFN-α的構(gòu)建 將鑒定為陽(yáng)性的重組克隆質(zhì)粒和原核表達(dá)載體pET-28a分別進(jìn)行雙酶切、回收、連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rossta中。PCR和雙酶切鑒定 （圖2和圖3）及測(cè)序結(jié)果顯示成功構(gòu)建了干擾素基因的克隆質(zhì)粒pET-28a-IFN-α。

2.4 原核重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 對(duì)鑒定為含有陽(yáng)性質(zhì)粒pET-28a-IFN-α的工程菌株進(jìn)行誘導(dǎo)，制備樣品后對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，重組雞α干擾素以包涵體形式存在。結(jié)果如圖4所示，在蛋白分子量為20.1～29 kD出現(xiàn)一條大小約為22 kD的特異性蛋白條帶，與預(yù)期的蛋白大小一致，對(duì)照菌樣品未表達(dá)該蛋白。

圖2 陽(yáng)性克隆株的PCR結(jié)果

圖3 陽(yáng)性克隆株質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果

圖4 重組雞干擾素蛋白SDS-PAGE結(jié)果

2.5 重組雞α干擾素的純化、Western blotting分析、復(fù)性及濃度的測(cè)定 大腸桿菌包涵體經(jīng)破碎、溶解和層析柱純化后再次進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖5所示。對(duì)純化后的重組雞α干擾素進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果如圖6所示，在預(yù)期蛋白條帶處出現(xiàn)明顯的重組α干擾素免疫印跡條帶。

圖5 純化后α干擾素SDS-PAGE

2.6 重組雞α干擾素的復(fù)性、凍干濃縮及濃度的測(cè)定 采用尿素梯度法對(duì)重組雞α干擾素進(jìn)行透析復(fù)性，對(duì)復(fù)性后的蛋白凍干濃縮后，采用BCA法進(jìn)行濃度測(cè)定，結(jié)果為472 μg/mL。

2.7 重組雞α干擾素抗H9禽流感病毒試驗(yàn)

2.7.1 H9禽流感病毒EID50的測(cè)定 將H9禽流感病毒按不同的稀釋度分別接種9日齡雞胚，3 d后收集雞胚尿囊液，進(jìn)行病毒血凝價(jià)的測(cè)定，記錄每組雞胚感染情況（表1）。計(jì)算得到每組雞胚感染率，通過(guò)EID50計(jì)算公式，獲得H9禽流感病毒的EID50為10-6.5/0.1 mL，即每枚雞胚注射0.1 mL 10-6.5稀釋倍數(shù)的病毒液，可導(dǎo)致50%的雞胚發(fā)生感染。

圖6 復(fù)性后α干擾素的免疫印跡結(jié)果

表1 不同稀釋度H9禽流感病毒對(duì)雞胚的感染情況

2.7.2 重組雞干擾素抗病毒活性測(cè)定 將9日齡雞胚隨機(jī)分為7組，同時(shí)設(shè)立生理鹽水對(duì)照組，將EID50病毒稀釋液與不同劑量（0、1.5、3、5.9、11.8、23.6、47.2 μL）的干擾素按0.1 mL等比例混合后，每枚雞胚注射混合液0.2 μL，每天照蛋1～2次，去除24 h內(nèi)死亡的雞胚，3 d后收集雞胚尿囊液，測(cè)定病毒血凝價(jià)（表2）。由表2可見(jiàn)，47.2 μg組和23.6 μg組與生理鹽水對(duì)照組相比，差異極顯著（P＜0.01），并且病毒血凝價(jià) ＜27，雞胚處于未感染狀態(tài)。

3 討論

隨著我國(guó)養(yǎng)雞規(guī)模的逐漸增大和集約化程度的不斷提高，疾病的發(fā)生、發(fā)展、流行、預(yù)防一直是行業(yè)內(nèi)關(guān)注的問(wèn)題，重大流行性疾病，尤其是原發(fā)性的病毒病，如新城疫、禽流感、雞傳染性支氣管炎等所帶來(lái)的危害越來(lái)越嚴(yán)重，給養(yǎng)雞業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，因此對(duì)病毒病的防治不容忽視，尋求一種好的治療型制劑顯得尤為必要。干擾素因其作用機(jī)理的獨(dú)特性而具有廣譜的抗病毒活性和免疫增強(qiáng)作用（Jennifer等，2009），一直是病毒學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。研究表明，重組干擾素與天然干擾素具有同樣的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)活性，因此重組干擾素的研究和應(yīng)用將成為家禽養(yǎng)殖中增強(qiáng)雞只免疫，減少發(fā)病，降低雞只死亡率的重要方向（周海龍等，2007）。但重組干擾素與天然干擾素相比又有著諸多不同，天然干擾素活性很好，但獲得手段相對(duì)單一，且產(chǎn)量不高，一定程度上影響了干擾素制品的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用；而重組干擾素則是利用基因工程手段，選擇不同的表達(dá)系統(tǒng)，可以獲得較高產(chǎn)量的干擾素。目前應(yīng)用相對(duì)比較成熟的是大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，有關(guān)資料報(bào)道的有的是對(duì)干擾素進(jìn)行表達(dá)，有的是對(duì)干擾素融合蛋白進(jìn)行表達(dá)，兩者主要區(qū)別在于融合蛋白相比之下，在脫離核糖體后，很快形成自身的結(jié)構(gòu)，提高中間蛋白折疊性而減少蛋白被降解的機(jī)會(huì)，使重組干擾素具有更高的穩(wěn)定性和表達(dá)產(chǎn)量 （王黎霞等，2010）。

表2 不同劑量重組雞干擾素抗病毒效果

本研究根據(jù)Genebank中發(fā)表的雞源α干擾素基因序列和大腸桿菌密碼子偏好性，對(duì)干擾素基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化后人工合成編碼干擾素成熟蛋白的基因序列，在此基礎(chǔ)上完成了干擾素重組質(zhì)粒Pet-28a-IFN-α原核表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)、復(fù)性后完成了抗病毒活性試驗(yàn)。試驗(yàn)證明47.2 μg和23.6 μg劑量的干擾素抗病毒效果與生理鹽水對(duì)照組相比，差異極顯著（P＜0.01），表明原核表達(dá)的重組干擾素具有較好的抗病毒活性。在整個(gè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程中，考慮到要在原核生物中表達(dá)真核基因，信號(hào)肽由于缺少相應(yīng)的受體而無(wú)法發(fā)揮作用，所以在人工合成基因片段的過(guò)程中，人為的去掉了干擾素信號(hào)肽序列。此外，在蛋白復(fù)性過(guò)程中重組干擾素存在析出現(xiàn)象，這一定程度上影響了蛋白的表達(dá)量，通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析了干擾素蛋白的等電點(diǎn)為8.9，與透析液的pH相近，可能是造成蛋白析出的重要原因之一。

4 結(jié)論

4.1 通過(guò)密碼子優(yōu)化，成功獲得了雞α干擾素的基因序列，并構(gòu)建了基因的克隆和表達(dá)載體。

4.2 IPTG誘導(dǎo)重組大腸桿菌，獲得了雞α干擾素，經(jīng)破碎、純化、復(fù)性后，測(cè)定蛋白濃度為472 μg/mL。

4.3 雞胚接種試驗(yàn)結(jié)果顯示重組雞α干擾素具有較好的抗H9禽流感病毒的活性。

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