飼用木聚糖酶基因的克隆及序列分析

四川農業(yè)大學生命科學與理學院 韓學易 李治國 陳 惠

木聚糖酶屬于水解酶類，是一類可以將木聚糖降解成低聚木糖或木糖的復合酶系（蘇玉春等，2008）。目前研究和應用較多的木聚糖酶多是來源于細菌、真菌和放線菌。較真菌所產木聚糖酶而言，細菌所產木聚糖酶具有更好的熱穩(wěn)定性（Panbangred等，1983）。本文報道了來自短小芽孢桿菌HZ-01產木聚糖酶基因的克隆及其序列分析，為下一步木聚糖酶的異源表達及其產業(yè)化應用奠定良好基礎。

1 材料和方法

1.1 載體與菌株 短小芽孢桿菌HZ-01由本實驗室 （四川農業(yè)大學生物化學與分子生物學實驗室）自行篩選；大腸桿菌DH5α為本實驗室保存；pMD19-T載體購于TaKaRa公司。引物合成和基因測序由上海英駿生物技術有限公司和北京諾賽基因組研究有限公司完成。

1.2 培養(yǎng)基和主要試劑 大腸桿菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。

T4 DNA連接酶與Taq DNA聚合酶（TaKaRa公司）；DNA限制性內切酶 （Fermentas公司）；DNA純化試劑盒 （TANGEN公司）；DNA Marker[天根生化科技（北京）有限公司]；質粒提取試劑盒（上海Omega生物技術有限公司）；蛋白胨和酵母粉（Oxoid 公司）；瓊脂糖（Amresco 公司）；其他均為國產分析純試劑。

1.3 木聚糖酶基因的擴增 以短小芽孢桿菌HZ-01基因組DNA為模板，根據網上木聚糖酶基因序列設計引物：

PCR擴增體系：總DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2X Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，總體積 25 μL。 PCR 擴增條件：94 ℃預變性 2 min，94 ℃變性 1 min，55 ℃退火 50 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸4 min。電泳檢測PCR擴增產物，純化回收，連接到T載體上，轉入感受態(tài)細胞，菌落PCR鑒定陽性轉化子。DNA測序由北京諾賽基因組研究有限公司完成。

1.4 木聚糖酶基因的序列分析 由網上提供的信息學數據庫和分子生物學軟件分析短小芽孢桿菌HZ-01木聚糖酶基因序列，并進行生物信息學預測。

2 結果與分析

2.1 木聚糖酶基因的克隆 以短小芽孢桿菌HZ-01基因組DNA為模板進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳后，得到一條大小約700 bp的特異條帶（圖1）。將目的條帶回收，連接到pMD19-T載體，轉入大腸桿菌，陽性克隆經菌落PCR檢測（圖2）及測序鑒定，表明成功克隆目的基因。

2.2 木聚糖酶基因的序列分析 PCR擴增產物由北京諾賽基因組研究有限公司測序（圖3）。測序結果表明，該木聚糖酶基因全長687 bp，GC含量為43%，共編碼228個氨基酸，理論分子質量為 25 kDa，等電點（pI）為 8.96。

采用NetNGlyc1.0在線分析軟件進行短小芽孢桿菌HZ-01木聚糖酶氨基酸序列N-糖基化位點（Asn-Xaa-Ser/Thr）的預測。在全長氨基酸序列中共有4個Asn殘基可能被糖基化：當閾值為0.5 時，分別為第 3、17、57、63 位。

利用MEGA4.0中codon usage對短小芽孢桿菌HZ-01木聚糖酶基因密碼子使用頻率進行分析，結果見圖4。由圖4可見，該木聚糖酶基因在密碼子選擇和使用上有明顯偏愛性，谷氨酸和半胱氨酸只出現一種密碼子，分別為GAA、UGU，亮氨酸未使用UUG、CUG，脯氨酸未使用CCC、CCG，異亮氨酸未使用AUA，丙氨酸未使用GCC，精氨酸密碼子使用具有明顯偏愛性，只出現CGU和AGA。

3 討論

周晨妍等（2005）采用RT-PCR技術擴增了宇佐美曲霉 （Aspergillus usamii）E001木聚糖酶（Xyn II）成熟肽和3’非編碼區(qū)的cDNA片段，DNA序列分析表明，該cDNA全長733 bp，其中3’非編碼區(qū)178 bp，成熟肽編碼區(qū)555 bp，編碼184個氨基酸。鄔敏辰等 （2007）以宇佐美曲霉E001基因組DNA為模板，采用單側PCR等技術擴增了木聚糖酶基因xyn I的DNA全序列，該DNA全長1098 bp，含啟動子序列、內含子和外顯子等核苷酸序列。白愛枝等 （2009）以黑曲霉（Aspergillus niger）A3的基因 組 DNA 為 模板，PCR擴增出了木聚糖酶xynB基因，通過序列分析，xynB基因的cDNA序列大小為678 bp，編碼225個氨基酸。本研究從自主分離的短小芽孢桿菌HZ-01基因組中克隆了木聚糖酶基因，該基因全長為687 bp，編碼228個氨基酸，理論分子質量約為25 kDa。

采用目前較為成熟的生物信息學在線分析數據庫和軟件包，來分析短小芽孢桿菌HZ-01木聚糖酶基因的糖基化位點和密碼子偏愛性，可以為其進一步的異源高效表達奠定基礎。對其糖基化位點分析時，當閾值為0.5時，氨基酸序列中共有4個潛在的 N-糖基化位點，分別為第 3、17、57、63位的Asn殘基。密碼子偏愛性分析表明，該木聚糖酶基因在密碼子選擇和使用上有明顯偏愛性，因此在進行異源高效表達時需要針對不同宿主進行高頻密碼子的定點突變或部分片段的人工合成。

本研究擬進一步對其表達載體進行構建，并分別在大腸桿菌和畢赤巴斯德酵母中進行表達，實現木聚糖酶高效表達，對其功能研究及生產應用均具有重要意義。

[1]白愛枝，閆祖威，唐國敏，等.黑曲霉木聚糖酶結構基因和5’調控區(qū)基因克隆及其分析[J].華北農學報，2009，24（5）：73 ～ 76.

[2]蘇玉春，陳光，白晶，等.木聚糖酶的研究進展[J].牧草與飼料，2008，2（4）：14 ～ 18.

[3]鄔敏辰，王時良，周晨妍.木聚糖酶基因xyn I的克隆和序列分析[J].林產化學與工業(yè)，2007，27（6）：59 ～ 64.

[4]周晨妍，符丹丹，朱劼，等.宇佐美曲霉木聚糖酶基因的克隆和序列分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（10）：29 ～ 32.

[5]Beg Q，Kapoor M，Mahajan L，et al.Microbiol xylanases and their industrial applications：a review[J].Appl Microbiol Biotechnol，2001，56：326 ～ 338.

[6]Panbangred W，Shinmyo A，Kinoshita S，et al.Purification and properties of endoxylanase produced by Bacillus pumilus[J].Agric Biol Chem，1983，47：957～963.

[7]Wong K，Tan L，Saddler J.Multiplicity of in microorganisms:functions and applications[J].Microbiol Rev，1988，52：305 ～ 317.